overnight or until tissue is dissolved;
More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;
Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;
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DNA提取原理和方法
核酸的理化性质
• 极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 钠盐比游离核酸易溶于水。
• 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液 中较稳定。
• 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于 细胞核中。
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DNA提取原理和方法
提取DNA总的原则 :
组织、6培养细胞
细DN菌A提、取酵原理母和方法
基因组DNA的提取
根据核酸分离纯化方式的不同有： ➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆 细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
酒精沉淀
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DNA溶液
DNA提取原理和方法
Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA
Approximately ~1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube; Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC
after 24 hr;
Proteinase K :
作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很 高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。
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DNA提取原理和方法
4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for
DNA extraction
ZJL
12014.05.09
DNA提取原理和方法
DNA extraction
• 细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结 合成核蛋白。
• 真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前 者为双链线性分子；后者为双链环状分子。
• 除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA； 在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。
Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times;
A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate;
Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;
If there is no pellet, place samples in -80ºC for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4ºC;
Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; Resuspend DNA in ddH2O. Use ~100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.
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DNA提取原理和方法
共价闭合环状结构
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DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
根据裂解方式的不同有：
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
应用
机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞 细菌、病毒 红细胞 细菌、酵母
物，从而达到分离目的。 7
DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物8
DNA提取原理和方法
基因组DNA－SDS法
作用：a. 溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性
2.Tris：缓冲液
作用：细胞裂解时PH值也能稳定
3.EDTA
作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。
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DNA提取原理和方法
3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete
2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC overnight or until tissue is dissolved;
Tail solution:
1.SDS ：十二烷基硫酸钠
1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过
高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
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DNA提取原理和方法
DNA提取的几种方法
基因组D粒DNA的提取