L-天冬氨酸的制备、应用及市场前景摘要：发酵法生产L-天冬氨酸，菌种及相关选育情况，所用原料的灭菌及预处理等情况，主要生产技术及关键控制点，主要分离纯化技术和分离、得率等，以及国内外的发展情况。

关键词：L-天冬氨酸，酶法制备，分离纯化，市场前景。

L-天冬氨酸又称L-天门冬氨酸，是一种常用的有机化工原料。

常见的L-天冬氨酸为无色片状结晶或者白色结晶粉末，无臭，略带酸味，主要作为食品添加剂、化工产品中间体和医药原料来使用。

目前国内L-天冬氨酸的生产均采用生物酶工程技术，本生产技术的原理是采用天冬氨酸酶将反丁烯二酸（即富马酸）氨解成L-天冬门氨酸。

HOOCCH=CHCOOH+NH 3HOOCCH 2CHNH 2COOH其工艺生产流程图如下：1 材料与方法1.1材料1.1.1菌种大肠杆菌，L-Asp 酶转化液，经活性炭脱色处理，质量分数为23％，二级种子 一级种子 杀菌 脱色 酶促反应 原料配制无菌空气 菌种斜面空压机 干燥 洗涤过滤 结晶 离心 检验 包装pH=8.87。

大肠杆菌分离纯化：配置牛肉膏蛋白胨培养基，配置后高压蒸汽灭菌并倒平板，将培养皿放入37℃的恒温培养箱中培养24-48小时，以检查是否灭菌彻底。

确定灭菌完全的培养皿可用平板划线法或稀释涂布平板法接种微生物。

大肠杆菌可从河道污水或者家禽、家畜生活附近的土壤中分离培养获得。

1.1.2培养基斜面养基：蛋白胨6g/L，牛肉膏2g/L氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。

种子培养基：碳源和氮源成分以及浓度按照实验设定值，硫酸镁0.5g/L，硫酸二氢钾2g/L，氯化钠3.5g/L，pH7.0。

原始种子培养基：富马酸15g/L，玉米浆20g/L,硫酸镁0.5g/L，硫酸二氢钾2g/L，氯化钠3.5g/L，pH7.0。

转化培养基：富马酸氨溶液，pH8.5。

1.1.3仪器与试剂分光光度计，恒温振荡器，阳离子交换树脂，自动旋光仪，数字熔点仪，离心机。

1.2方法1.2.1培养条件培养温度为37℃培养时间为26h左右1.2.2酶反应取一环生长良好的斜面种子装于有30mL种子培养液的250mL培养摇瓶中，37℃、180r/min下恒温摇床培养16h得到种子液。

取种子液10mL，在5000r/min下离心10min，用生理盐水冲洗2~3次，加入100mL富马酸氨溶液，在温度为37℃、转速为180r/min的条件下进行酶转化反应，用HPLC 测定反应液中富马酸含量，待富马酸含量降至较低值时需加底物溶液，直到转化速度较慢时结束反应。

1.2.3产物的分离因为L-谷氨酸脱羧酶能专一的催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸和二氧化碳而L-天冬氨酸不被作用，可用L-谷氨酸脱羧酶分离L-谷氨酸和L-天冬氨酸。

在100mL三角瓶中加入湿菌体，0.5g，混合物0.6g，0.2mol/L醋酸缓冲液（pH=5.0）30mL吐温-80 0.01g，于35℃，170r/min震荡反应30min。

取2mL反应液，添加0.2mol/L硼酸缓冲液（pH=9.0)2mL,使酶反应终止，离心去除菌体。

以berthelot显色法测定转化液中的γ-氨基丁酸。

比活定义为在35℃，pH=5.0时1g湿菌体1h所转化产生的γ-氨基丁酸的μmol数，单位为U，1U=1.0μmol/g.h。

1.2.4测定方法菌体生物量的测定通过发酵液OD值体现菌体的生物量，即样品菌液经摇匀后吸取菌液2mL定容于50mL容量瓶中，在640nm波长处测定吸光值。

发酵液OD值与细胞干质量之间的线性关系为Y（干质量）=0.1709xX（OD 值）-0.0042，线性回归因子为0.997。

富马酸含量测定从酶反应中吸取0.4mL，定容于100mL容量瓶中，在280nm处测定吸光值。

依据标准曲线计算出浓度。

L-天冬氨酸定性检测分析（纸层析法）用30cmx28cm层析滤纸，溶剂系统为正丁醇、冰乙酸及水的质量比为4:1:2。

上行展开10~11h，展开至距顶端1~2cm处。

用pH7.5的0.05％的溴酚蓝乙醇溶液显色。

L-天冬氨酸用0.5％的茚三酮溶液显色。

转化率定义在底物富马酸溶液中，底物转化率=（底物初始浓度-底物终止浓度）/底物初始浓度。

1.2.5 L-天冬氨酸的结晶过程加酸量与pH的关系取转化液100mL，恒温于80℃，滴加40％硫酸调节pH，记录pH随加酸量的变化，作pH值变化曲线。

L-天冬氨酸的结晶操作取转化液100mL，恒温于80℃，滴加40％的硫酸调节pH至4.3左右，加入一定量的晶种，再滴加40％硫酸至pH为2.8，控温冷却至室温，过滤，干燥至恒重。

2结果与讨论2.1优化培养基成分的选定目前都是采用富马酸作为直接碳源，蛋白胨、牛肉膏蛋白胨作为直接氮源进行发酵培养L-天冬氨酸的转化菌。

菌体培养--酶形成的过程曲线从斜面上挑取一环菌苔接种到装有50mL培养基的500mL三角瓶中，37℃摇瓶培养，间隔取样，分别测定培养液的OD值、pH、基质富马酸含量及酶活，得到菌体培养。

2.2酶反应温度对富马酸转化量的影响取50mL培养液分别于37℃和50℃温度下进行酶反应。

50℃时开始酶活很高，第1、2d酶反应很快，转化富马酸的量占总量的90％，以后酶反应缓慢，说明50℃时第三天酶开始失活。

而在37℃进行酶反应，前5d反应速度基本不变，第6d酶反应缓慢。

比较底物的转化率，37℃转化率较高，考虑生产成本，选用37℃进行酶反应。

2.3酶的失活情况将50mL培养液于37℃静置放置，每隔1d测其酶活，观察酶的失活情况，见图。

由酶失活曲线可知，当酶处于静置状态时，经4d，酶活剩余40％，第5d，酶活剩30％，第6、7d后，酶活只有20％。

与处于反应状态相比较，可以看出，酶在静置状态失活更快些。

2.4酶浓度、底物浓度对反应速度的影响在50mL培养液中一次性加入底物溶液600mL，此时酶浓度恒定，为e1，定时测定富马酸浓度，计算不同富马酸浓度时的反应速率，可以绘出这一酶反应过程中不同底物浓度和反应速度的关系曲线。

随着反应进行，富马酸浓度降到1％e2时，底物浓度以下的时候再一次加入底物溶液600mL，同样测出酶浓度为e1，和反应速率之间的关系。

3 L-天冬氨酸的生产应用及市场分析3.1生产应用3.1.1作为食品添加剂由于L-天冬氨酸是酸性氨基酸，带有酸味，故可直接作为酸味调节剂。

它有两个羧基，容易生成稳定的天冬氨酸盐，可用于各种食品的营养强化和风味的调节。

如天冬氨酸钠是一种鲜味剂，也可以与呈味核苷酸等并用，且具有解除人体疲劳的特殊功效，在发达国家如日本等正在逐步代替味精。

3.1.2用于合成甜味剂由L-天冬氨酸为主要原料合成的甜味剂阿巴斯甜其作为蔗糖的替代品，用量持续增长。

鉴于阿巴斯甜专利权已到期，使生产成本降低，作为代替蔗糖的首选甜味剂，欧美国家需求劲强。

3.1.3 合成聚天冬氨酸由L-天冬氨酸为主要原料合成的聚天冬氨酸（PASP），属于生物高分子材料，具有很好的生物相容性和降解性，近年来主要应用于水处理剂、化妆品、分散剂、螯合剂、医药、水凝胶、农用化肥等领域。

研究表明，PASP进入环境中可以完全生物降解，属于环境友好型绿色化学品。

尤其从20世纪90年代开始，随着环保意识的增强，该产品逐渐受到世界上各大化学公司的关注。

3.1.4用于合成新药与临床治疗氨基酸衍生物已广泛用作抗肿瘤药物，如N-磷酸乙酰-L-天门冬氨酸是一个天冬氨酸转氨甲酚基酶的过渡状况抑制剂，利用这个抑制剂可中断嘧啶核苷酸的合成途径达到抗肿瘤目的。

以亮氨酸和酯化的天冬氨酸共聚而成的仿天然皮肤的层状伤口裹敷物，包扎伤口后可以不必再解开而成为皮肤的一部分。

天冬氨酸钾、钠在临床上主要作为心脏病治疗药物、肝功能促进剂、氨解毒剂和氨基酸输液成分。

3.2 技术进展L-天冬氨酸的工业化生产始于上世纪七十年代的日本，早期采用传统的微生物发酵法，即以糖类物质为基础原料，通过细胞的新陈代谢来积累产物，再经过适当的提取精制工艺而制成。

由于该工艺生产周期长，副产物多且技术风险大，使产品的生产成本较高，价格的高昂也限制了产品只能应用于医药领域。

随着后来生物酶技术的发展，特别是固定化酶技术研究的不断深入，该产品的生产也逐步向该领域靠近。

到了八十年代，由于采用酶法生产所需的主要原料——富马酸能得以大量廉价生产，故也使得以固定化酶法进行生产的技术被开发出来，并且逐步取代了传统的发酵工艺，成为当时主要的生产方法。

我国在20世纪八十年代中后期开始了对该产品的研制与开发，并且成功地进行了中试，随后也有了小批量的工业化生产，采用的基本上都是固定化酶法生产技术。

该工艺设备投入多，技术要求高，使产品的生产成本相对较高。

随着近年来市场竞争的日趋激烈，怎样降低生产成本，提高产品质量成为了关键；而固定化酶法由于其工艺上的限制，决定了其无法再降低成本。

3 .3市场分析3.3.1 市场需求分析由于L－天冬氨酸主要用在食品添加剂、合成阿斯巴甜、丙氨酸、聚天冬氨酸方面。

而这些产品的市场需求逐年加大，尤其是阿斯巴甜，目前全球有一百多个国家在使用，产量已增至1.8万t/a。

随着肥胖和糖尿病的高发，对低热量食品的需求在加大，加上阿斯巴甜的专利权限已到期，使生产成本降低，作为代替蔗糖的首选甜味剂，欧美国家需求强劲。

3.3.2 国内生产状况我国L-天冬氨酸的生产历史不长，规模化生产的时间在上世纪九十年代中后期，经过十多年的发展，已形成了一定的生产规模，合计年生产能力约在8～10万吨左右，但厂家也是良莠不齐，生产规模在5000吨以上的只有为数不多的几家，其余的都在2000吨以下。

近几年由于L-天冬氨酸的应用范围不断扩大，需求大幅度增长，尤其在合成阿斯巴甜和聚天冬氨酸方面，国际国内需求量的增加导致产量也在逐年增加，有些公司正是看到了其潜在的市场需求，正在积极介入这一领域。

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