第二章常规组织病理技术
活体组织检查:活检的目的
●协助临床对病变作出诊断或为
疾病诊断提供线索
●了解病变性质、发展趋势,判
断疾病的预后
●验证及观察药物疗效,为临床
用药提供参考依据
●参与临床科研,发现新的疾病
或新的类型,为临床科研提供
病理组织学依据
活检的应用范围
●协助临床对病变作出诊断或为
疾病诊断提供线索
●了解病变性质、发展趋势,判
断疾病的预后。
●验证及观察药物疗效,为临床
用药提供参考依据
●参与临床科研,发现新的疾病
或新的类型,为临床科研提供
病理组织学依据
活检标本类型
●手术摘除的器官、组织,如阑
尾、甲状腺、胆囊、淋巴结
等
●穿刺抽取组织,如肝、肾、淋
巴结的穿刺组织●自病变部位切取的小块组织,
包括用纤维胃镜、纤维支气管
镜等内镜钳取的病变组织
●刮取的组织:刮出的子宫内膜
组织(诊刮),外科手术刮取的
病变骨组织等
活体组织标本的固定与送检
●固定存放送检
组织与细胞的取材
●一张好的切片是保证病理诊断
和科研结果准确性的前提和基
础
与正确的取材、合适的固定和良好的染色密切相关
组织处理要求
完整保存组织细胞的形态
最大限度保存组织或细胞成分的抗原性
抗原不弥散,以保证其准确定位
组织取材
(一)一般原则
●厚度0.2～0.3c m;面积1～
1.5c m2
●较薄的皮肤、腔道器官及囊壁
组织等应剪成细条缠绕成同心
圆状
●骨组织需先经脱钙处理
●若需保存新鲜组织,应将所取
组织用锡箔纸包好,浸入液氮
速冻,然后置-70℃冰箱中
(二)取材注意事项
刀剪应锋利、避免前后拉动和挤压
●避免使用有齿镊,动作轻柔以
免挫伤或挤压组织
●避开坏死组织和血凝块,去掉
异物
●取病变主体、病变与正常交界
和正常组织各一块
固定及常见固定剂
一、概念:将组织浸入某些化学试剂中,使组织细胞内的物质能尽量保持其生活状态时的形态结构和位置
二、固定的作用
1.保持组织、细胞与生活状态时相似的结构和形态,防止组织自溶和细菌繁殖导致的组织腐败
2.保持细胞内蛋白质等成分凝固并定位于原有部位
3.便于区别不同的组织成分:固定可使组织细胞中各种成分沉淀、凝固并易着色
4.有利于切片:固定剂兼有组织硬化的作用,能使组织细胞从半液体
状变为半固体状
5.有利于免疫组化染色和核酸原位杂交:完整保存及准确定位抗原、
D N A和R N A成分
三、组织固定的注意事项
1.取材后要及时固定,特别是温度高的季节,以免腐败
2.容器:最好选择广口的容器,一是避免组织受挤压变形,二是方便
取材时易于取出
3.固定液要足量,至少应为组织块总体的5倍以上
4.根据不同研究目的选择不同的固定液
M a s s o n染色,最好用甲醛升汞、Z e n k e r液或b o u i n液固定
●保存细胞内糖原应选用C a r n o y
液固定
●显示尿酸盐结晶可用100%酒精
固定
5.固定时间:视组织块大小、固定温度、固定液种类而定
●一般固定6小时以上,然后保存
于70%酒精中
●温度低于4℃时,固定时间应延
长
●比较大的标本除延长固定时间
外,还应做多个切面固定,以
免固定不均匀
四、固定方法
1.浸泡法
2.蒸汽固定法:常见于固定组织中的可溶性物质
3.灌注固定法:用于组织块过大或固定剂难以进入其内部的标本(如整个器官、整只动物)
4.滴加法:细胞涂片
5.微波固定法(63℃～65℃):具有核膜清晰、染色质均匀、组织结构收缩小等优点,但由于其固定时间不易掌握,一般不主张运用于小组织块固定
常见固定液及其配制
(一)单纯固定液:由单一化学物质组成
1.甲醛
(1)优点:价格便宜、组织穿透力强、固定均匀、组织收缩小,可长期保存标本
(2)缺点:易挥发,有一定毒性
(3)性质:交联性组织固定剂
(4)适用范围:适合多种特殊染色,对脂类和类脂体、神经及髓鞘均有良好的固定效果;也可固定高尔基体、线粒体和糖类
(5)使用浓度:10%f o r m a l i n,即10m l市售原液(40%)加90m l的水,此液的甲醛实际浓度为4%
2.中性甲醛
以p H7.2～7.4的磷酸缓冲液(P B S)为溶剂配制的甲醛溶液,浓度同前
●优点:固定效果及对组织抗原
的保存均优于一般甲醛溶液
●是科研用组织最常见的固定液
3.乙醇
(1)优点:具有硬化、固定、脱水等作用,还能保存糖原和尿酸结
晶
(2)使用浓度:固定组织用80%～95%为好,70%的乙醇可用于保存组织;证明尿酸结晶和保存糖原用100％浓度
(3)缺点:
●组织渗透力较弱
●能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋
白,核蛋白沉淀后能溶于水,
使核染色不良
●高浓度乙醇固定的组织硬化显
著,组织收缩明显且脆,既影
响切片,又致组织形态改变,
影响诊断
●溶解脂肪、类脂质和血红蛋白,
还损害其它色素
(二)混合固定液:由多种化学物质混合组成
1.A-F液
酒精-甲醛固定液
●固定兼脱水,固定后可直接入
95%酒精脱水
●配制方法:95%以上浓度酒精
90m l,40%甲醛10m l,混合而成2.B o u i n液
(1)优点:渗透力强,对组织固定均匀,收缩很小,不会使组织变硬变脆,适用于睾丸活检等小组织的固定
(2)固定时间:小块组织只需数小时,较大脏器固定12～24小时(3)配制方法:苦味酸饱和水溶液75m l,40%甲醛水溶液25m l,冰醋酸5m l
80%酒精150m l,40%甲醛60m l,冰醋酸15m l,加入结晶苦味酸1g(用前配制)
3.Z e n k e r液
(1)优点:H E染色最好的固定液,此液固定的标本,胞核和胞质染色
清晰
(2)固定时间:12～24小时
(3)缺点:配制该液的试剂较昂贵,且需处理汞
(4)配制方法:
重铬酸钾2.5g,升汞5.0g,蒸馏水100m l
●将升汞、重铬酸钾和蒸馏水混
于烧杯中,加热(40～50℃)溶
解,冷却后过滤,贮存与棕色
瓶中
●临用时取贮存液95m l,加入冰
醋酸5m l
4.C a r n o y液
●(1)优点:
●穿透力强,能很好地固定胞质
和染色质
●特别适合固定外膜致密的组织
●在固定组织的同时,能溶解大
部分脂肪
●用于糖原及尼氏小体的固定
●对显示D N A和R N A的效果很好
(2)固定时间:小块组织固定1～2小时
(3)配制方法:无水乙醇60m l,冰醋酸10m l,氯仿30m l。
(4)缺点:氯仿有毒
组织的脱水、透明浸蜡和包埋:切片前的处理过程,主要目的是便于
切薄片和长期保存组织块
一、脱水
●用某些溶媒(脱水剂)置换组
织内水分的过程
●脱水剂必须能与水任意比例混
合
●常见脱水剂:有乙醇、丙酮及
叔丁醇(2-甲基-2-丙醇)
●丙酮引起组织收缩作用强而较
少应用
●为了减少组织的急剧收缩,应
使用从低浓度到高浓度递增的
顺序进行,一般从70%浓度开始,
经80%、95%直至无水乙醇
二、透明
●组织块中的水分被透明剂所取
代,组织块变得透亮的过程
●最常见的透明剂为二甲苯,因
其既能与酒精混合,又能溶解
石蜡
●处理时间一般为30m i n左右
●其它透明剂:苯、甲苯、氯仿、
环己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、
冬青油和苯胺油等
三、浸蜡
●组织透明后在熔化的石蜡内浸
渍,让蜡液完全渗透入组织细
胞内的过程
用于浸渍的石蜡熔点为52℃～56℃
浸蜡时间一般为3小时,需更
换3次石蜡液
浸透或透入:用其它浸透剂
(火棉胶、碳蜡、明胶等)渗入组织内部的过程
四、包埋
组织块经过浸蜡或浸透后,再
用包埋剂包起来的过程
●包埋后的组织块具有一定的硬
度和柔韧性,有利于切薄片
●常见的包埋剂:石蜡、火棉胶、
碳蜡、明胶和塑料等,可根据
不同的研究需要选用。