根瘤菌项目的过程以及总结1 国内外研究概况及选题的目的意义1.1国外研究状况：根瘤菌剂在世界范围得到推广和普及，世界上许多国家，如美国、日本、英国、法国等。

固氮细菌、解磷细菌和解钾细菌的研究也及其广泛。

我国微生物肥料的研究应用和国际上一样，也是从豆科植物上应用根瘤菌接种剂的开始的，并且在上世纪50—60年代期间，根瘤菌剂成为应用最广泛的微生物肥料产品，其中大豆、花生、紫云英接种面积较大，增产效果明显。

其他微生物肥料的研究应用也取得了一定的进展。

1.2 我国微生物研究应用和国际上是一样，也是从豆科植物上应用根瘤菌接种开始的，并且在上世纪50-60年代期间，根瘤菌成为应用最广泛的微生物产品，其中大豆、花生、紫云英及豆科牧草接种面积较大，增产效果明显。

其他的微生物肥料产品的研究也取得了一定的进展，上世纪50年代，我国的就已经从原苏联引进了细菌肥料，随后有推广使用自制的细菌肥，近年来又不断研发和制造有机复合肥，均取得较大的效益。

例如，晟微复合微生物发酵液是由中国农业大学专家教授在充分借鉴外国先进复合肥微生物技术的基础上，采用微生态工程技术，精选多种功能益生菌经特殊工艺发酵而成。

庆阳市陇东学院王鑫教授致力于此方面的研究并取得了显著地成效。

甘肃省庆阳市华池县探索出了“全膜玉米种植—玉米秸秆青贮—青贮秸秆养畜—畜禽粪便制沼（制肥）—沼气能源利用—沼渣沼液还田—发展有机农业”的循环经济模式，有效解决了畜禽养殖粪便污染问题，为畜禽养殖污染防治树立了样板。

.3 研究的目的意义:为了获得各种有机肥,从而发展可持续农业、生态农业畜禽类尿，如此丰富的生物质资源如果合理开发利用就会变废为宝，就会造福社会，否则就会影响水源和空气。

为了进一步提高有机肥的肥效充分利用植物秸秆以及消除恶臭物质的散发，杀灭病原微生物，我们选定了这样的题目，其目的是为研发功能性生物有机肥，提供可能的依据。

新型生物发酵有机肥料可克服施用化肥带来的种种弊端，又有传统肥料肥效长的优点，达到了速效与长效的和谐统一，既能改良土壤结构、培肥地力，保水保肥，又能保持土壤的通透性，改善和恢复土壤微生态体系的平衡，提高作物的产量和品质。

不仅能有效地利用有机肥资源、变废为宝，同时治理和避免了日益严重的环境污染.此外，有机肥产业的发展还可以从根本上解决有机废弃物对大气、水和土壤环境的污染，使农业生产走可持续发展的道路。

2 研究的主要内容：我们在预实验的基础上，针对鸡饲料抗生素含量过高，所引起的鸡粪真菌未检出的问题，以纯鸡粪为主要材料，配合玉米秸秆粉和牛粪，接种液体冠菌与秸秆腐熟剂菌种，设置不同处理进行发酵，研究不同配方鸡粪在微生物发酵过程中，总有机碳含量、腐殖质及游离腐殖质含量以及随发酵时间的变化规律，并研究样品的浸提液对种子发芽指数的影响，为选择最优肥料发酵配方提供科学依据。

3实验材料与方法3.1实验方案及设计表1 鸡粪发酵有机肥料实验方案（单位：kg）西峰区彭原乡养鸡场的新鲜鸡粪5000kg，玉米秸秆450kg，新鲜牛粪450kg，液体冠菌6.75kg，秸秆腐熟剂0.9kg。

新鲜冬小麦种子500g。

3.3鸡粪制堆方法分别称取新鲜鸡粪1000kg(物料含水率72%左右，按照上述处理添加各种辅料，加入不同的菌剂，冠菌液添加等量红糖，加水稀释20倍，用机动喷雾器喷洒均匀，秸秆腐熟剂和秸秆粉混合均匀，翻混三次，制成堆高80 cm、顶部削平的发酵堆。

用表头式温度计从发酵堆顶部垂直插入，深度30 cm，待温度升高到50度以上时开始翻堆，每天一次，温度达到65度以上时，每天需多次翻堆。

每天定时测定堆温三次(在翻堆前测定温度)；翻堆后堆制成原形状。

发酵时间：夏季7-10天，春秋季15-30天。

第一次翻堆时采样一次，以后每隔三天采样一次，采取三个重复样品。

3.4采样方法：沿堆顶垂直切成剖面，随机采取堆中10个以上的点，20~30 cm堆层物料1000 g，及时带回实验室冷藏，待分析测定用。

3.4腐熟的外观标准：物料疏松，无原臭味，略有氨味，堆肥表面均匀分布白色菌丝，表示完全腐熟。

3.5 仪器设备与试剂3.5.1 仪器设备电热干燥箱，培养箱，分光光度计（具585nm波长，并配有10mm比色皿），红外线消煮仪，水浴锅。

培养皿50套。

3.5.2 试剂及配置方法(1) 0.8000mol/L (1/6 K2Cr2O7)标准溶液:将K2Cr2O7(分析纯)先在130℃烘干3~4h，称取39.2250g，在烧杯中加蒸馏水400ml溶解，冷却后，稀释定容到1L。

0.27moL/L K2Cr2O7溶液：将K2Cr2O7(分析纯)先在130℃烘干3~4h,称取80.0000g，在烧杯中加蒸馏水400ml溶解，冷却后，稀释定容到1L。

(2) 碱性焦磷酸钠溶液。

用表面皿称取焦磷酸钠15.00g，氢氧化钠7.00g于烧杯中，加水200mL，搅拌使其溶解，定容为1000mL，贮于带橡皮塞的玻璃瓶中。

(3) 邻啡罗林指示剂（分析纯）：称取硫酸亚铁0. 695g和邻啡罗林1.489g，溶于100mL水中。

(4) 10.00g/L葡萄糖（C6H12O6）标准使用液：称取10.00g葡萄糖溶于适量水中，溶解后移至1000mL容量瓶，用水定容，摇匀。

该溶液贮存于试剂瓶中，有效期为一个月。

(5) 浓硫酸（分析纯）：ρ（H2SO4）=1.84g/L，含量98%(6) 硫酸汞（分析纯）3.6实验具体操作及步骤3.6.1 电热干燥箱恒温加热-重铬酸钾氧化-分光光度法测总有机碳的含量。

实验中，统一用150℃电热干燥箱恒温加热30m in替代传统的油浴法测发酵肥料的有机碳含量，提取液中腐殖酸和游离腐殖质的分析测定。

标准曲线的绘制：分别量取三组0.00、0.50、1.00、2.00、4.00 和 6.00ml 葡萄糖标准使用液于100 ml具塞锥形瓶中，分别加入 0.1g硫酸汞和5.00 ml 重铬酸钾溶液，摇匀。

再缓慢加入7.5 ml硫酸，轻轻摇匀。

开启电热干燥箱，设置温度为150℃。

当温度升至接近100℃时，将上述具塞锥形瓶放入电热干燥箱中，以仪器温度显示150℃时开始计时，加热30分钟。

然后关掉电热干燥箱开关，取出具塞锥形瓶水浴冷却至室温。

向三个处理的具塞锥形瓶中缓慢加入约50ml水，继续冷却至室温。

再用水定容至100 ml刻线，加塞摇匀。

于波长585nm 处，用10 mm比色皿，以水为参比，分别测量吸光度。

以零浓度校正吸光度为纵坐标，以对应的有机碳质量（mg）为横坐标，绘制校准曲线。

测定：准确称取试样0.1-1g，小心加入至100mL具塞锥形瓶中，避免沾壁。

按照标准曲线绘制方法，加入试剂，加热, 30min，冷却、定容。

将定容后试液静置1h，取约80mL上清液至离心管中以2000r/min 离心分离10min，再静置至澄清；或在具塞锥形瓶内直接静置3~4h至澄清。

在波长585 nm处，用10mm比色皿，以水为参比，分别测量吸光度。

同时做空白试验。

结果计算与表示鸡粪中的有机碳含量（以干重计,质量分数，%），按照公式（1）（2）进行计算。

（1） m1=m×w100dmω=[( A- A0)/b×m1×1000]×100（2）oc式中：——试样中干物质的质量，g；m1m ——试样取样量，g；w——鸡粪的干物质含量（质量分数），%；dmω——鸡粪样品中有机碳的含量（以干重计，质量分数），%；ocA ——试样消解液的吸光度；——空白试验的吸光度；Aa ——校准曲线的截距；b ——校准曲线的斜率。

3.6.2 腐殖质及游离腐殖质的测定3.6.2.1 腐殖酸总量的测定3.6.2.1.1 方法原理根据腐殖酸能溶解于碱性溶液的特性，在测定总腐殖酸含量时，用焦磷酸钠碱性溶液做提取剂，它能和腐殖酸钙、镁盐中的离子络合，形成焦磷酸钙、镁沉淀，难溶的腐殖酸钙、镁盐转化为可溶的腐殖酸钠盐被提取出来。

浸提出的腐殖酸，在强酸性溶液中能被重铬酸钾氧化，根据重铬酸钾的消耗量，计算出腐殖酸的含量。

3.6.2.1.2 操作步骤称取样品约0.200g放入250mL三角瓶中，加碱性焦磷酸钠溶液70mL，摇匀，放在沸水浴中30min（中间振荡几次）,取下冷却至室温。

将提取液通过小漏斗洗入100 ml 的容量瓶中，再用水洗涤三角瓶数次，洗液全部倾入容量瓶内，定容。

过滤于干三角瓶中，弃去最初滤液。

分别准确吸取滤液5.00mL 和0.8000mol/L (1/6 K 2Cr 2O 7 )溶液5.00mL 放入250mL 三角瓶中，加入浓硫酸15mL ，迅速摇匀，放在沸水浴中加热30min 。

冷却至室温，然后加入80mL 水，加3滴邻啡罗啉指示剂，用硫酸亚铁溶液滴定至溶液由黄绿色变为砖红色为终点，记录硫酸亚铁的用量，同时做空白试验。

或者直接用比色法测定含碳量。

3.6.2.1.3 结果计算总腐殖酸(%)=（1V －2V ）×c×3×0.001×分取倍数×100／（m·f）式中：21,V V ——分别为空白测定和样品测定所消耗的硫酸亚铁的体积（ml ）；c ——硫酸亚铁的浓度（mol/L ）；分取倍数——样品提取液的总体积（ml ）／测定时所用提取液的体积（ml ）； 3——（1／4C ）原子的摩尔质量（g ／mol ）； m ——称取干样品的质量（g ）；f ——腐殖酸的含碳量系数（泥炭0.58，褐煤0.64，风化煤0.67）； 两次平行测定结果的允许差：总腐殖酸含量（%） 允许差（%） ﹤20 2 ≥20 33.6.2.2 游离腐殖酸含量的测定游离腐殖酸的测定，方法原理均与测定腐殖酸总量相同，其不同之处，仅仅是将碱性焦磷酸钠溶液，换为10g ／L 的氢氧化钠溶液，提取液中腐殖酸的测定和计算均与测定腐殖酸总量相同。

两次平行测定结果的允许差：总腐殖酸含量（%） 允许差（%） ﹤20 2 ≥20 3 3.6.3种子发芽指数的测定将不同配方的畜禽类粪便微生物发酵剂用去离子水浸泡1小时培养皿内垫1张滤纸,均匀放入30颗冬小麦种子，加入以上浸提滤液5.0mL，在25℃黑暗的培养箱中培养48 h后，统计种子发芽个数，测量根的长度，记载在下表。

（4）计算发芽率并测定根长，然后用以下公式计算种子的发芽指数[3].每个样品做3个重复,同时以去离子水作空白试验。

结果计算：发芽系数=处理的发芽率×处理的根长/空白的发芽率×空白的根长×100%.结果记录：表2 种子发芽指数记载表实验预期结果和进程：1、预期结果：研究出使得有机碳，腐殖质含量最高，对种子发芽指数最好的最佳配方。

2、实验进程:2013年6月--2013年8月：完成开题报告和文献综述；2014年3月-201年5月：完成实验内容，获得数据；2014年5月-2014年6月：撰写论文，整理和补充数据，完成论文，答辩。