分子生物学技术在食品工业中的最新研究进展0引言了解食品中的微生物群落组成以及不同微生物种群之间的相互作用，对于生产出安全和高品质的食品是非常重要的。
食品生产过程中相关微生物的研究通常采用培养的方法，但这种方法存在很大的局限性：①富集培养大多具有选择作用，导致不能分离出具有重要生态学作用、数量相对较少的种群，不能定量研究微生物种群的动态变化；②受到食品环境胁迫或受损的微生物细胞，通常需要特殊的培养条件才能恢复生长，导致其难以被分离。
大量的研究表明，传统的微生物学培养分析方法，获得的可培养微生物种群只占微生物总量的0.1%-5%。
尽管对于微生物群落结构相对简单的食品来说（如发酵食品），可培养的微生物一般占有优势，但Ampeul认为，至少有25%～50%的微生物种群不能被培养。
这种缺陷促进了以聚合酶链反应(PGR)技术为基础的分子免培养方法和核酸检测技术在食品微生物研究中的应用和发展。
与常规培养方法相比，分子生物学技术具有快捷、灵敏、准确等优点，而且具有更高的特异性，能够更加精确地研究生态系统中的微生物多样性及其群落组成。
微生物学家已经认识到研究微生物生态学概念和理论，对于了解食品中微生物的繁殖与生长非常重要。
譬如研究微生物群落组成能够更好地了解奶酪、酸奶、香肠、葡萄酒、面包等食品的风味组成以及微生物对其储藏品质的影响；密切监测食品生产过程中微生物群落的动态变化，能够更好地了解和控制食品加工和后熟过程中的微生物作用；可以快速、准确地监测食品中可能存在病原微生物，以加强食品生产过程中的安全性等。
因此，在种、菌株水平上，对食品环境中微生物的准确监测和可靠鉴定以及微生物群落组成、动态变化的生态学研究，有助于保证食品的质量安全。
与土壤、水环境等生态系统的研究相比，到目前为止，用于食品加工过程中微生物研究的分子生态学的方法还相对较少，目前使用最多的是变性梯度凝胶电泳技术。
尽管如此，这些方法在食品工业中（尤其在发酵食品中）正逐渐被使用。
中国的传统发酵食品行业历史悠久，品种多样，如食醋、酱油、白酒、黄酒、豆豉、腐乳、酸菜、乳酪以及发酵肉制品等。
传统发酵食品工艺多为天然发酵，其微生物群落结构比较复杂，产品风味具有明显的地域性。
传统的发酵行业对酿造工艺过程中的微生物群落动态变化、风味及功能性物质的形成和累积机制的研究明显滞后，对传统发酵工艺的机制缺乏深入了解。
以天然的复杂菌种混合发酵工艺为主的绝大多数企业，其生产质量控制主要靠工程技术人员长期工作积累的经验来判断，难以对发酵产品品质进行稳定的控制。
分子生态学技术能够对发酵过程进行定量监控，通过检测发酵过程中微生物群落的组成结构、种群动态变化情况，有助于从整体上进行全面的分析，深入认识微生物的发酵机制，并为监控和调整发酵过程奠定基础。
1 目标基因的选择自20世纪80年代中期以来，PCR技术已成为科学家们用来研究微生物群落结构及多样性的最主要工具。
一般而言，以DNA为模板，利用通用引物通过PCR 反应扩增目标基因，产生的基因序列大小相同，因此需要依据基因序列的差异来区分不同的微生物。
所以，分子生态学研究的关键步骤就是选择合适的目标基因。
合适的目标基因既要有保守区段，又要有可变区段。
可变区段可以在不同的分类水平上区别微生物，保守区段位于可变区段两侧，用来作为引物复性结合的位点进行PCR。
如果没有高度保守区域，较低保守程度的区段也可作为简单引物退火结合的位点。
通常在分子生态学研究中，主要采用能够反映微生物系统发育关系的、在微生物基因组中普遍存在的基因作为PCR扩增的首选目标。
此外，编码蛋白的功能基因也可被用来研究微生物类群的功能多样性。
目前，由于细菌rRNA操纵子（包括16S rRNA基因、23S rRNA基因以及基因间隔序列，IGS）在所有的微生物类群的基因组中都存在，而且符合以上微生物分子生态学研究作为分子标记的条件，是目前微生物生态学研究中最常用的分子标记。
尤其在RDP等基因序列数据库中，已经积累了几千万的基因序列，能够很方便地通过比较来描述某一群落中存在的微生物种群。
目前发现，rRNA基因序列有时并不具有足够的序列差异来区别亲缘关系很近的、占据不同生态位的分类单位。
Palys等人在研究相近群落中一些细菌的生态多样性时，证明蛋白质编码基因序列比16S rRNA基因更为有效。
此外，由于大多数细菌基因组中rRNA基因存在多个拷贝，其序列的差异使得分子生态学结果的解释和分析复杂化。
因此，单拷贝的、不同分类单位之间显示较大序列差异的持家基因越来越受到更多的关注，这些基因包括促旋酶基因(gyrB)、延长因子基因(tuf）、热激蛋白基因(dnaK)、RNA聚合酶基因(rpoB)以及reeA基因等。
然而，与16S rRNA基因相比，这些基因在数据库中目前只有少量的序列，这使得它们在微生物生态学中的应用受到很大的限制。
对于特定环境中某个具体的微生物生态学过程，可以通过分析生态学过程中发挥关键作用的功能酶基因的多样性以及确定优势基因的多态性来监测生态系统的功能多样性。
对于土壤和水环境而言，功能多样性分析过程主要包括氮素循环、硫酸盐还原、氨氧化以及多环芳烃化合物的降解等。
就目前来看，虽然已有一些利用功能基因来分析检测和鉴别食源性人类病原体的报道，但迄今为止，还没有在食品工业中利用功能基因多样性进行食品微生物生态学作用研究的报道。
这方面有待深入研究。
2食品微生物群落分析技术研究微生物群落一般采用3个基本指标，即多样性、相似度和丰度。
目前用于微生物群落分析的大多数分子技术并不全面，只能从一个侧面帮助了解微生物群落。
基于PCR技术研究微生物群落的方法有：①利用通用引物扩增产生混合PCR产物，再通过其他技术进一步分析；②通过特异性的PCR反应检测和定量特殊功能类群的微生物或目标基因。
分子生物学技术在食品工业中的最新应用研究见表1。
2.1食品微生物多样性研究方法2.1.1 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)，通过PCR扩增相同长度的的DNA片段(200-700 bp)，其PCR正向引物的5 7末端带上一个35～40 bp 的GC发卡结构，以保证扩增的DNA片段在变性凝胶中至少能保持部分的双链结构。
依据DNA序列差异具有不同的变性浓度或者温度，在变性剂梯度或者温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，检测微生物多样性。
理论上，可以检测和区分只有1个或几个碱基对差异的核核酸片段。
1999年DGGE技术首次应用于食品微生物学，Ampe[1研究了墨西哥玉米发酵面团中的微生物空间分布。
此后，DGGE技术被广泛应用于分析食品及其相关产品的微生物群落组成差异及监测微生物种群数量动态变化，包括矿泉水、葡萄酒、香肠、乳制品、发酵木薯面粉、牛肉、鱼等。
16S rRNA基因V3区段由于长度与序列的种属差异使得该区段在食品微生物DGGE/TGGE技术中作为首选的目标序列。
最近，一些DGGE技术以mRNA进行PCR来研究生理代谢活跃的种群多样性。
DGGE技术和TGGE技术的主要优点是在许多分子实验室都可以进行，而且结果的解释相对简单。
但是，由于PCR产物片段很短，序列所含信息较少，使得微生物的分类鉴定准确度降低；而且，不同的序列可能有相同的电泳迁移率，导致了不同片段的共迁移。
DGGE/TGGE技术的最主要缺点是缺乏可重复性，另一个缺点是普通凝胶的染色方法使得其灵敏度较低，导致一些代表稀有种群的带丢失，使用荧光标记的引物可提高检测的灵敏度。
2.1.2单链构象多态性(SSCP)另一种依赖于PCR产物电泳分离，并已用于微生物群落分析的技术是单链构象多态性(SSCP)。
与DGGE/TGGE技术不同，SSCP技术以单链折叠产物的构象差异为基础分离PCR产物。
变性后，单链DNA片段在非变性条件下，由于核苷酸序列不同，形成的二级结构不同，分子量相近的产物被分离。
一般情况下，SSCP 与DGGE/TGGE技术具有相同的优缺点。
由于引物不需要带发卡结构，PCR扩增结果比DGGE或TGGE更有效。
SSCP技术主要的缺点是由一个单链DNA片段可能会形成几个稳定的构象，导致凝胶中出现多个带。
此外，在分析多样性较高的复杂微生物群落时，需要上载较高浓度DNA样品，DNA单链在电泳时重新复性的概率很高。
SSCP已被用于研究不同环境中的微生物群落，但在食品工业的应用中，目前仅限于干酪微生物的研究。
2.1.3末端限制性内切酶片段长度多态性T-RFLP是另一种以PCR技术为基础的群落带谱分析法，通常用于比较分析微生物群落。
目标基因首先被荧光标记的引物扩增（只有1个引物被标记），然后酶切，最后在自动测序仪上分离和检测。
在电泳峰图中，只有被标记的末端限制性内切酶片段能被检测出，其长度的不均匀性表明群落的复杂性。
选择的限制酶越多，T-RFLP的检测灵敏性越高，能够检测单个碱基差异的核酸片段，而且能够很好的同时检测大量的样品，譬如确定多个样品微生物群落结构的时空变化。
这种方法在精确预测微生物群落结构有一定局限性，由于不完全或非特异的限制性酶切，产生假的限制性片段，导致微生物多样性的过高估计。
另一个限制因素是软件预测和实验获得的限制性片段实际长度之间的差异。
此外，一个不确定因素是由于荧光染料的选择引起的，要仔细的评估引物和标记染料，优化实验方法。
尽管存在缺陷，T-RFLP还是一种非常有效的微生物群落分析的分子技术，尤其需要高通量和高灵敏度分析时，不需要直接的序列信息。
T-RFLP技术的有效性在微生物生态学中不同研究领域已经得到广泛的体现，在食品工业中，T-RFLP技术也被越来越多的成功应用于微生物群落分析，譬如水产业、酸奶和奶酪生产以及制糖工业。
2.1.4扩增核糖体DNA限制性分析扩增核糖体DNA限制性酶切分析(ARDRA)，也被称为16S rRNA基因的限制性片段长度多态性(RFLP)，是一个相对简单的PCR技术为基础的指纹图谱技术，先酶切PCR扩增的群落rDNA，然后通过凝胶电泳分离。
这种技术能够被用于微生物鉴定，也可以比较微生物群落和动态变化。
与T-RFLP技术不同，检测到所有的酶切片段，虽然提高了分辨水平，但增加了图谱的复杂性，不能有效的比较和解释图谱。
由于单个限制性内切酶不具有高的分辨力，多个限制性内切酶单独或者组合使用有可能获得较好的结果。
该技术另外一个缺点是由于凝胶中染色剂的检测灵敏度有限，导致微生物群落中丰度较低种群不能检出和系统发育信息的丢失。
因此，只有在分析组成相对简单的群落时，该技术才被首选。
目前，还没有发现该方法用来研究食物中微生物多样性的报道。
2.1.5核糖体间隔区分析微生物核糖体基因间隔区(IGS)在长度和核苷酸序列上比16S rRNA和23S rRNA基因具有更大的差异（长度一般在400-1 200碱基），因此在菌株水平上被广泛用来对微生物进行分型研究。