HSCCC分离纯化芦荟中的有效成分及结构鉴定方仲根在《芦荟的活性成分与疗效作用》中提出：新鲜芦荟所含的成份十分复杂，至今发现其含有以芦荟素为首的160多种有效成份，另外尚有其他未知物质多达数百种。
芦荟的药用成份大致可分为以下几类：植物石炭酸成份、蒽醌类物质、糖类、氨基酸、有机酸、多种矿物质微量元素、活性酶、维生素等。
这些成分可广泛添加于医药、美容和保健品中，它神奇的药用价值也已经被多个实例所证实1,如从斑纹芦荟中分离得到的芦荟苦素证实具有抗肝炎、中和毒素、抗肿瘤的作用；芦荟多糖是高效的机体促进剂，能通过恢复和提高机体的免疫功能起到抗肿瘤的作用；而我们的目标物芦荟苷更具有健胃、泻下，可抗过敏，排毒，防紫外线等作用2。
蒽醌苷类物质主要由大黄素及其苷类组成，其主要物质有芦荟苷、7-羟基芦荟大黄素苷、大黄酚及其苷、蒽酚、高那特芦荟素、芦荟皂草等3。
芦荟所含的蒽醌类还有二聚体形式存在的。
芦荟苷属于蒽醌苷类，为极性化合物，是由糖分子与蒽酮10位上的碳原子直接连接形成的苷，称为C苷。
其易溶于甲醇、乙醇中，在热水中也可溶解，冷水中溶解性较差，几乎不溶于苯、乙醚、氯仿等非极性溶剂。
芦荟苷化学性质比较稳定，只有经过水解除去糖后才易被氧化，芦荟苷有荧光反应，而且在不同的pH值下会出现不同的荧光。
芦荟苷中含有酚羟基所以具有一定的酸性，能与不同的碱形成类盐物。
所以在碱性溶液中比在中性的有机溶媒中溶解度大得多4。
芦荟苷存在两种同分异构体A和B，两者的差异在于葡萄糖基团在蒽酮基的位置不同（两者的葡萄糖基都在10位的碳上发生取代，芦荟苷A分子具有反式结构。
芦荟苷B分子具有顺式结构），而且两者组成的比例因使用的提取方式不同易发生变化。
结构式如下5：研究背景：芦荟有效成分多样复杂，而且很多化学成分的性质是非常相近的，因此分离芦荟中各种单体的技术还不成熟，现在应用的芦荟产品大多数是芦荟提取的混合物，如果能制备性分离芦荟中的有效成分，应用于药品和保健品中，特别对医疗行业将会是一个很有利的发展方向，因此，能够建立一种提取分离芦荟活性成分的方法和技术，在天然药物研究中将会是一大进步。
由于提取分离纯化芦荟苷的技术的限制，在对芦荟苷功能性质方面的研究还比较缺乏，很多功效的研究都是基于对蒽醌类物质总功效的研究，而芦荟苷是蒽醌类物质的代表，也是芦荟蒽醌类物质的主要成分，所以把功效归功于芦荟苷，要验证芦荟苷的具体功效也需要对芦荟苷进一步分离纯化。
本课题的核心即是寻找到高速有效分离纯化芦荟苷的方法。
一、分离提取芦荟活性成分的常用方法：色谱法：蒽醌苷类因分子含有糖，故极性较大，水溶性较强，分离和纯化都比较困难，一般都主要应用色谱法。
但在色谱之前，往往采用溶剂法或铅盐法处理粗提物，除去大部分杂质，制得较纯的总苷后再进行色谱分离。
羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）由于其分子筛特性，可按分子量大小分离物质外，在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的效果，适用于不同类型有机物的分离，在天然药物分离中得到了越来越广泛的应用。
其中芦荟苷的分离也有实例证明，将所得芦荟苷粗提晶体溶解于70％甲醇中，溶液上于Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以70％甲醇不断冲洗，分段收集。
所洗脱依次得到：芦荟大黄素双葡萄糖苷、大黄酚葡萄糖苷、芦荟苷6。
后段收集淡黄色结晶，减压浓缩至干，即得到精制芦荟苷结晶。
所得芦荟苷纯度交高，分离效果较好。
虽然Sephadex LH-20可以反复使用，柱子的洗脱过程就是柱子的再生过程，但价格仍比较昂贵。
同时由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。
因而分离操作一般较慢。
而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。
此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。
凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。
所以对于芦荟中分子量较接近的蒽醌类衍生物是否能够达到有效的分离还有待研究。
聚酰胺吸附色谱法商品聚酰胺是由酰胺键聚合形成的高分子化合物，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂。
其酰胺基可与羟基酚类，酸类，醌类，硝基等化合物以氢键形成结合而被吸附，至于吸附强弱则取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力，其脂肪长链可作为分配层析的载体。
聚酰胺在含水系统中层析时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行为反向柱层析；在非水溶剂系统时，聚酰胺作为分配层析的载体，其层析行为为正向柱层析。
在聚酰胺柱色谱分离时，通常用水装柱，试样也尽可能做成水溶液上柱以利于聚酰胺对溶质的充分吸附，随后用不同浓度的含水醇洗脱，并不断提高醇的浓度，逐步增强从柱上洗脱物质的能力。
特别适应于多元酚类化合物的分离，如黄酮、醌类、酚酸、含羰基化合物、羧基化合物等。
刘太平等人采用聚酰胺树脂富集与纯化芦荟蒽醌类化合物,通过对照乙醇梯度洗脱所得各组分的HPLC谱图,考察聚酰胺树脂富集、纯化芦荟蒽醌的吸附性能和洗脱参数，并采用40% , 60% , 70% , 80%乙醇梯度洗脱,发现聚酰胺可以使芦荟蒽醌衍生物得到较好的分离9。
但聚酰胺柱层析时，易由于机械强度不大，粒度不均匀，而引起分离时流速较慢，一些小分子杂质混入的问题。
如果能够解决杂质混入的问题。
由于其操作简单，如果能够弥补它的不足，将会是一个分离芦荟苷的很好方法。
大孔吸附树脂法（影响因素较多）：大孔吸附树脂又称聚合物吸附剂，大多为白色球形颗粒，具有三维空间网状结构的高分子聚合物，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物的选择性较好，不受无机盐及强离子低分子化合物的影响。
大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合的分离材料。
不同类型的大孔吸附树脂极性、孔性结构也都不同，对化合物的吸附分离也不同。
并且还可以结合不同中药化学成分的结构特点设计合成相应的专用树脂。
大孔吸附树脂的这些结构上的灵活性、使用范围的广谱性是其他分离技术不可比拟的。
大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理结合的分离材料，与以往使用的离子交换树脂分离原理不同。
它本身具有的吸附性，是由于范德华引力或产生氢键的结果。
筛选性原理是由于其本身多孔性结构所决定。
正因为有这些特征，使得有机物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。
由于吸附性和筛选性原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，吸附在大孔吸附树脂上的化学成分经一定的溶剂洗脱而分开。
大孔吸附树脂孔径、比表面积及构成类型被分为许多型号，在应用中，可根据实际要求及化合物特性加以选择7。
芦荟主要含蒽醌类和多糖类等活性成分，目前对于大孔吸附树脂对芦荟有效成分进行富集纯化的研究报道比较少，但其可行性已由张美玲论证8。
而且实验结果表明NKA-ⅡH和CAD45树脂对芦荟苷都有较好的吸附性能，对芦荟有效成分的富集和纯化是可行的，而且完全可以克服传统加工方法存在的溶剂残留、污染，产率低等问题，而且大孔吸附树脂可以再生重复利用。
但分离方法操作繁琐，影响因素较多，分离纯度较低，可考虑用于成分的粗分。
张美玲针对大孔吸附树脂对芦荟苷分离纯度低的问题提出采用大孔树脂对芦荟苷进行粗分离，后经硅胶柱层析（TLC法定性检测芦荟苷流出的位置）进一步纯化得最终芦荟苷成品，并用LC-GC或GC-MS联用对种产品进行定性分析。
硅胶为极性吸附剂，吸附力的大小取决于被分离物质的极性（极性越大，吸附力越强）和洗脱剂的极性（容剂极性越弱，硅胶对分离物质的吸附能力越强）。
因此，用硅胶吸附色谱分离一组极性不同的混合物时，极性大的物质因吸附力大二洗脱慢；洗脱溶剂的极性增大，洗脱能力增强，洗脱速度加快。
此法虽然能提高所得芦荟苷的纯度但操作更加繁琐。
高速逆流色谱法：高速逆流色谱法(high speed counter current chromato-graphy, HSCCC)是一种高效快速的液-液分配色谱新技术。
因其不使用载体, 避免了有效成分被色谱载体的不可逆吸附, 且分离纯化同步完成, 有机溶剂消耗少。
欲用HSCCC进行成功的分离,选择适宜的溶剂系统非常重要。
不同的溶剂系统,具有不同的上、下相之比(比重轻者为上相,重者为下相) ,其黏度、极性、密度等性质相差甚远,对相同的成分具有不同的溶解、分配能力,形成分配系数的差异,对分离效果产生不同的影响。
高速逆流色谱溶剂系统的选择可以通过薄层层析的分配系数来确定。
高速逆流色谱法：高速逆流色谱法(high speed counter current chromato-graphy, HSCCC) 是一种高效快速的液-液分配色谱新技术。
因其不使用载体, 避免了有效成分被色谱载体的不可逆吸附, 且分离纯化同步完成, 有机溶剂消耗少，是分离科学技术的一个新分支。
该技术是一种不用固态吸附剂的全液态的色谱方法。
由于不使用固态支撑体,与其它的色谱技术相比, HSCCC能够完全消除支撑体导致的样品不可逆吸附和对样品的沾染、失活、变性等影响,实现复杂混合物中各组分的高纯度分离。
而用HSCCC进行成功的分离,选择适宜的溶剂系统非常重要。
不同的溶剂系统,具有不同的上、下相之比(比重轻者为上相,重者为下相) ,其黏度、极性、密度等性质相差甚远,对相同的成分具有不同的溶解、分配能力,形成分配系数的差异,对分离效果产生不同的影响。
高速逆流色谱溶剂系统的选择可以通过薄层层析的分配系数来确定。
高速逆流色谱法的特点：1、应用范围广，适应性好。
由于溶剂系统的组成及配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC可以适用于任何极性范围内样品的分离，在分离天然化合物方面具有其独到之处。
由于聚四氟乙烯管中的固定相为液体(不需要固相载体)，因而可以消除固一液色谱中由于使用固相载体而带来的吸附损失，特别适用于分离极性物质。
2、操作简便，容易掌握。
仪器操作简单，对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。
3、回收率高。
HSCCC不需要固相载体，消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，理论上样品的回收率可达100%。
在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
4、重现性好，如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，即使多次进样，其分离过程都保持很稳定，而且重现性相当好。
5、分离效率高，分离量较大。
由于其与一般的色谱分离方式不同，能实现梯度洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高，制备量大。
二、高效逆流色谱法的研究进展：溶剂系统的选择对于HSCCC分离十分关键。
遗憾的是到目前为止溶剂系统的选择还没有充分的理论依据，而是根据实际积累的丰富经验来选择。
根据溶剂系统的极性，可以分为弱极性、中等极性和强极性三类。
经典的溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙醋-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等11。