姓名：何青学号：1224143003 专业：生物医学信息技术荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用随着光电子技术，尤其是激光技术的发展，越来越多的现代显微技术迅速发展起来。

目前，通过激光光源以激发被测物体的荧光或者非线性光学现象从而获得高分辨率的成像的技术就有：激光共聚焦显微技术、双光子荧光显微技术、二次谐波显微成像技术以及拉曼光谱成像技术等。

通过能量密度比普通光源高数十乃至数百倍的激光可以激发被测物的各种非线性光学现象，而被测物内部不同组织、不同成分的部分将显示不同的光学性质（如激发光的强度或者波长不一样），从而将这些不同部分区分开来，提高了显微系统的分辨率。

荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用日益广泛，技术发展也突飞猛进，成为热门的研究领域，并发展了突破衍射极限的超高分辨率荧光显微成像系统[1]。

现就目前应用比较广泛的激光扫描共焦显微镜和多光子激光扫描显微镜进行介绍。

1 激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜是近年来发展较为迅速的无创诊断技术。

它以光学系统的共焦成像为基础，利用光扫描技术对样品进行无创动态测量，目前已经发展成为生物学和医学研究诊断的重要工具，在生物医学的各方面得到了广泛的应用。

1.1 激光共聚焦扫描显微镜基本原理如图1所示，激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，采用双针孔的结构以形成物像共轭。

激光通过透镜聚焦在焦平面上针孔形成点光源，并在物镜焦平面对样品逐点扫描,样品上的每个照射点在像焦平面的探测孔处成像。

进行点扫描时，扫描点以外的点不会成像。

，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。

由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。

调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像。

逐点、逐行、逐面快速扫描成像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

图1激光共聚焦扫描显微镜基本原理示意图1.2激光共聚焦显微镜的应用领域激光扫描共聚焦显微镜是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。

既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。

目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等领域得到广泛应用。

激光共聚焦显微镜的具体应用领域包括：多重荧光影像 ( Multi-Color Fluorescence Imaging )3D 立体影像重建 ( 3D Reconstruction )3D 动态影像获取与分析 ( Dynamic 3D imaging )神经立体分布影像 ( 3D Neuron imaging )形态与动态分析 ( Morphology )次微米单晶荧光影像技术 ( Nano-crystal )多重荧光蛋白影像技术 ( Multi-Color GFP Imaging )细胞离子流定量分析 ( Cellular Ion Concentration and Ratio Imaging )长时间影像记录 ( Time-Lapse Recording )Z轴扫描与测量 ( Z-section and measurement )基因影像分析 ( Genetic FISH imaging and quantification ) 染色体多重荧光原色表现 ( Chromosome spectral analysis )活体胚胎研究 ( Embryo, Zebrafish / Drosophila embryo )穿透光影像 / 反射光影像材料表面分析 ( Surface and roughness analysis )材料显微硬度分析 ( Micro-Hardness analysis )晶园分析 ( Wafer analysis )薄膜分析 ( Thin layer analysis )2 多光子激光扫描荧光显微镜近年来，光学显微镜技术中的一个最引人注目的成就是双光子激发现象(two-photon excitation，简称TPE)在共焦激光扫描显微镜(confocal laserscanning microscopy，简称CLSM)中的广泛应用⋯．随着飞秒激光技术和光学显微镜技术的发展，现在人们已经能够比较容易地制造并使用双光子共焦激光扫描显微镜(two—photon laser scanning microscopy，简称TPLSM)，对样品在双光子激发后发出的荧光进行观察和三维成像．目前, 以双光子技术为代表的多光子技术已经在生物及医学成像、单分子探测、三维信息存储、微加工等领域得到广泛应用, 为开拓新学科和促进科学研究领域向更高层次发展起到了非常重要的作用．利用双光子共焦激光扫描显微镜的特点揭示了许多新现象和新规律，展示了广阔的发展前景。

2.1多光子激光扫描荧光显微镜基本原理多光子激光扫描荧光显微镜在激光照射下，基态荧光分子或原子吸收一个光子后成为激发态，随后又弛豫到某一基态，同时以光子形式释放能量而发出荧光．这一过程就是通常的单光子激发情况．1931年，Maria G6ppert—Mayer预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中，同时吸收两个光子而成激发态，这种情况就是双光子激发过程．1961年，Kaiser等在CaF2：Eu”晶体中首次观察到了这种双光子激发现象．比如在单光子激发情形，NADH酶在350nm 的光激发下产生450nm的荧光，而在双光子激发情形，NADH酶则需同时吸收两个700nm 的光子才能产生450rim的荧光．这就是说，双光子技术可以使我们无需使用紫外光源就能达到检测紫外荧光探针的目的，由于双光子激发所产生的荧光强度与激发光的光强平方成正比，因而与单光子激发的线性过程相比，双光子激发就需要很强的激发光强，这就使双光子激发具有很高的空间局域特点[2]。

图2 光子激发示意图2.2 多光子激光扫描荧光显微镜的应用领域多光子共焦激光扫描显微镜已延伸到各个研究和应用领域. 它能对处在自然状态下的样品进行三维无损观察,并能提高系统的分辨率和信噪比.利用多光子激发后材料性质的变化,还可以实现三维高度数据存储和三维任意方向的微细加工,具有很高的应用价值. 可以相信,随着与多光子共焦显微镜相关的机械、材料、激光技术等的进一步发展多光子共焦激光扫描显微镜将得到更大的发展和更广泛的应用.3 激光扫描共焦显微镜和多光子激光扫描显微镜的比较激光共聚焦显微镜是80 年代随着光学、视频、计算机等技术的飞速发展而诞生的新一代显微镜。

自从1957 年马文·闵斯基在他的美国专利上首次阐明扫描共聚焦显微镜技术的某些基本原理, 激光显微镜技术得到逐步发展。

1970年牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜, 它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或激光激发荧光探针。

能够得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,由于它采用激光作光源, 发射角小, 方向性好, 在发射光检测光路上放置了一个与入射光针孔共轭的检测针孔, 使焦平面的光可以通过检测针孔, 而来自焦平面上、下的光被阻挡在针孔的两边。

因此, 可得到高清晰度的图像。

目前, 激光共聚焦显微镜已发展到拥有12 通道, 0b ~ 360b 旋转扫描,配以微幼步进马达控制载物台的升降, 对样本进行无损伤光学切片, 获得其三维立体结构可在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、pH 值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化, 成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

但激光共聚焦显微镜存在如下问题: ( 1) 要求共聚焦即照明针孔与探测针孔共轭; ( 2)探针对样品深度的干扰; ( 3) 样本遭到光漂白作用和光致毒作用。

多光子激光扫描显微镜的应用使这些问题迎刃而解。

多光子吸收的历史可追溯到1931 年, 当时M1 G1Meier做出了高光强度下多光子吸收会发生的理论预断[ 3] , 1961年在贝尔实验室用脉冲红宝石激光器激发铕离子荧光时首次观察到双光子吸收, 1989 年在美国康奈尔大学W1 Denk、J1H1 Stricker 和W1W1Webb 制成第一台多光子激光显微镜。

此后, 多光子激光显微镜在生物医学领域发挥了重要的作用。

现将两者作简单比较。

（1）多光子激光扫描显微镜采用飞秒激光器, 其惊人的应用之一是敏感的生物结构现象, 它容许的峰值功率密度大于1011WPcm2, 比激光共聚焦扫描显微镜105WPcm2 要高许多。

激光共聚焦扫描显微镜采用可见光激光, 能量连续激发,多光子激光扫描显微镜采用波长较长的红外激光, 能量脉冲式激发, 红外光比可见光在生物组织中的穿透力更强, 因此多光子激光扫描显微镜更能解决生物组织中深层物质的层析成像问题, 扩大了应用范围。

（2）激光共聚焦显微镜是单光子激发, 在整个扫描焦平面以及扫描上下都产生荧光的激发, 采用与照明针孔共轭的探测针孔, 使焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 从而提高了显微镜的分辨率, 但与此同时, 在生物样品的整个扫描面及扫描面上下, 造成荧光大范围的激发, 从而导致整个组织的广泛漂白和光动力学损伤。

多光子激光扫描显微镜采用多光子激发, 这是一个非线性过程, 具有准确的定位特征, 也就是只有在焦点处的光子才能激发荧光分子, 光漂白和光损伤仅局限于焦点附近, 且有利于减少测试样品的自发荧光,这样可以对活细胞进行更长时间的观察。

（3）激光共聚焦扫描显微镜因为有荧光大范围的激发, 所以需要共焦针孔来选择荧光。

多光子激光扫描显微镜的荧光激发只发生在焦点, 不需共焦针孔选择荧光, 因此测量光路更加简单、可靠、有效, 设备简单易携, 故障率低。

（4）多光子激光扫描显微镜比激光共聚焦扫描显微镜具有更准确的定位, 因而保证了更高的三维分辨率, 使背景的干扰相对减少, 进一步提高了图像清晰度。

（5）多光子激光扫描显微镜的荧光波长远离激发光波长, 因此多光子显微镜可实现暗场成像。

（6）激光共聚焦扫描显微镜在生物医学方面经常应用于细胞内游离钙测量, 细胞内pH 测量、荧光原位杂交分析, 免疫组化, 膜的流动性, 胞间通讯等方面。

多光子激光扫描显微镜除具有上述功能外, 在以下方面有着更多的应用:在特制的培养皿上可杀死或移动不需要的细胞, 分离单层贴壁细胞, 在细胞生长表面作微区划分, 长时间观察细胞生长, 建立维护混合细胞体系, 进行肿瘤移植, 控制细胞生长速度,建立稳定的细胞系, 建立细胞原代培养, 进行药物筛选。