操作步骤
• 通过PCR或RT-PCR获得目的基因 • 构建重组表达质粒 • 获得含重组表达质粒的表达菌种 • 诱导表达
诱导表达

挑取含重组质粒的菌体单克隆至5ml含相应抗生素的LB液 体培养基中37℃振荡过夜培养。（同时以空载体作为对照 ） 按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌液接入到100ml
防止二价Ni被还原。
不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失。 建议在破碎细胞的时加入蛋白酶抑制剂，如0.11mM的PMSF，防止目的蛋白被降解。
缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水
相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v）。 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间。 可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween等，最 高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染。

LB液体培养基中， 37℃振荡培养2-3h。

取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入诱导剂 IPTG至终浓度0.8mM作为实验组，37℃继续振荡培 养3h，4h，5h，6h 。

不同时间点分别取1ml菌体，12000rpm离心1min 或8000rpm离心6min收获菌体沉淀，用40ul灭菌水 重悬沉淀，加入5×蛋白上样缓冲液10ul混匀， 沸水煮5min。 剩余的样品（约95ml）然后12000rpm离心1min，用 灭菌水重悬菌体，用低温超高压细胞破碎仪或超声 破碎仪破碎重悬的菌体，4℃ 12000rpm离心10min ， 上清倒入另一管中，沉淀用10ml的灭菌水重悬，然后 分别取40ul，加入5×蛋白上样缓冲液10ul混匀， 沸水煮5min，做SDS-PAGE等分析。

Tips

与超声波破碎仪相比，低温超高压连续流细胞 破碎仪的优点有： 保持细胞活性（4-6℃的环境） 省时

不同菌体的破碎最适压力是不同的。 例如：一般大肠杆菌的破碎压力为1000mpa， 压力过大可能会对蛋白的活性有影响。
选择表达宿主之前，要先对靶基因中的密
码子进行分析。
如果有细菌不常用的密码子，需要考虑更换 表达菌株。例如:不能使用BL21(DE3)进行表达， 可以选择Rosetta系列菌株，如Rosetta 2。这种携 带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充了大肠杆菌 缺乏的七种（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，所以这类菌 株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成 的表达限制。
记录测定结果。
用灭菌水清洗侦测台5-6次，退出系统，关闭计算机。
存备用。
Tips
透析第一天更换TE buffer次数稍多一些，换5次 左右，后两天的次数可减少，早中晚各一次。 使用前沸水煮5min即可，冷却后装样，加样时要 带手套，防止手上油脂堵塞透析袋的孔，影响透 析效果。用时要检查是否会有液体的漏出，使用 后的透析袋应浸泡在20%的酒精中。 若蛋白浓度太高，在透析的过程中会有蛋白的析 出，建议在加入透析袋之前做等量体积的稀释。 透析之后的蛋白分装到EP管中，既避免浪费，又 可避免蛋白因反复冻融而影响自身的活性。
• 加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min。 • 2000 rpm离心5 min，收集上清。 • 重复上述两步骤至少两次。
• SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，微量紫外分光光
度计检测蛋白浓度。 • 将蛋白分装置于-80℃保存。
Tips
各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA等。 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，如DTT，
在进行SDS可能是： • 由于静电荷的原因相差10kDa左右 • 由于稀有密码子的问题也会造成表达产物 的截短（特殊情况）
蛋白质的提取与纯化
实验原理
亲和层析就是通过将
具有亲和力的两个分子中一 个固定在不溶性基质上，利 用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分子进行 分离纯化。被固定在基质上 的分子称为配体，配体和基 质是共价结合的，构成亲和 层析的固定相，称为亲和吸 附剂。
• 4℃ 12000rpm离心20min，取上清 。 • 加20% PEG4000 至终浓度为0.2％，50mM （0.03g/mL）的氧化型谷胱甘肽至终浓度为１mM，
100mM（0.03g/mL）的还原型谷胱甘肽至终浓度为
2mM，静置2小时。 • 以1×TE（pH8.0)透析72小时，取出分装后-80℃保
蛋白浓度测定
特点
检测只需1微升的样本，适用于极 微量样本的检测。
直接使用加样器将待检测样本加在
检测的表面上，无需使用比色皿和 毛细管。 不浪费样本，节省消耗品费用。 样本无需进行稀释，即可进行快 速、简便的检测，检测范围宽。
操作步骤
在主画面点选“Protein A280”，计算机与仪器自动完成 联机。 先用灭菌水清洗侦测台5-6次，最后一次点“OK”确定。 依照Pro所溶于之液体准备该溶液取出2ul点在侦测台 上，放下上臂后再按“Blank”。 将样品混匀，取出2ul点在侦测台上，放下上臂后再按 “Measure”。
GST标签蛋白的纯化
• 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm 离心1min集菌，然后用 PBS洗涤诱导后的菌体2-3次，Buffer A（一般用1/10体 积）重悬菌体，超声波破碎至清亮 ，12000rpm离心 20min取上清，在上清中加入适量经处理过的50%的 Glutathione Sepharose 4B，室温摇床轻轻晃动作用1h，使 蛋白充分吸附。 • 2000 rpm离心5min，弃上清。 • 加入至少10倍体积PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B 悬浮于溶液中，2000rpm离心5min弃上清。 • 重复上步两次。
原核表达
实验原理
大肠杆菌是重要的原核表达体系,在重组 基因转化入大肠杆菌菌株以后，通过温度 的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白 质，然后将表达样品进行SDS-PAGE以检测 表达的蛋白质。 实验室常采用IPTG诱导外源基因表达，不 同的表达质粒表达方法并不完全相同，由 于启动子不同，诱导表达要根据具体情况 而定。
不溶性包涵体的提取
• 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm离心1min集菌，PBS洗涤 菌体2-3次，然后用Buffer A（一般用1/10体积）重悬菌体， 超声破碎至清亮。 • 4℃ 12000rpm离心20min，弃上清。
• 用PBS洗涤沉淀2-3次。
• 往沉淀中加19.7ml Buffer A以及19.7ul的DTT(终浓度为 0.5mM/L)及0.3ml 20%的SKL贮存液，剧烈搅动，使其缓 慢溶解，4℃静置过夜。