原理：食品匀液经DEFT膜过滤，膜放在培养基表面，恒温培养至 微菌落长出，显微镜观察 G- 3h G+ 6h。
快速检ห้องสมุดไป่ตู้技术：特殊滤膜（0.5um）过滤样品液 ；滤膜经吖啶橙染 色；紫外光显微镜观察；
活细胞 橙色荧光 ； 死细胞 绿色荧光
20~30min
（四）最近似数测定法（MPN）
选择3个稀释梯度的稀释液，每种稀释液接种3管（5管）装有 培养基的试管中培养，根据实验结果查MPN检索表，得到样品中微 生物数量。 MPN的优点：方法相对简单；与SPC相比，相似率较高；用选择
菌落总数：在一定条件下，每克（每毫升）样品中所含CFU（菌落形成单位）。 测定方法：
检测样品的处理
稀释
倾注（涂布）平板
培养
计数
报告
国标规定：
在需氧条件下：
细菌
NA 37 ℃ 48h
霉菌 酵母 PDA 25~28 ℃ 5天
1、样品的预处理 （1）取样：无菌操作 25g放入225mL灭菌生理盐水的无菌瓶内 （ 1：10稀释液） （2）均匀混合 ：均质器
粮 三层五点（表、中、下）
油 重点采取表层及底层油
（1）面包、糕点、方便食品采集方法： ❖ 取原包装，用无菌镊子夹下包装纸采取外 部及中心部位检样共200g，带馅糕点直接 采取外皮与内陷25g。
❖ （2）豆制品样品采集：采取接触盛 器边缘、底部及上面不同部位样品 200g放入灭菌容器内。
❖ （3）乳及乳制品
应用： 乳品工业上原料乳中的微生物检测 优点： 简便、快捷和经济
缺点：不同的微生物还原能力不同，给估算 带来了一定的困难。
不适用于含有还原酶的食品
两种染料：
亚甲基蓝（兰色）
白色
刃天青（暗兰色）
粉红色或白色
染色还原的时间与样品中微生物浓度成反比
（六）显微直接计数法 （Direct microscope count, DMC）
肉眼观察；放大镜； TTC（氯化三苯基四氮唑) 显色:培养基中加入
TTC作指示剂, 细菌细胞脱氢酶使其还原生成红色的不溶于水的三苯基甲簪 ( TF)，使菌落中心产生红色。
6、菌落计数的报告：报告单位： cfu/g(mL)
（1）平板菌落数的选择： 细菌30~300；真菌30-100
（2）稀释度的选择：
高。 缺点： ❖设备投资较高 ❖含颗粒样品容易堵塞管道 ❖如果样品的带菌量超出范围则结果准确性降低 ❖对琼脂平板表面要求高
（三）膜过滤
SPC方法的改良：过滤膜的孔径为 0.45um；收集菌体以提高检出 率；直接显微计数；膜过滤与荧光染色方法结合 直接荧光膜技术计数法（ DEFT ）Direct Epifluorescent Filter Technique： 微菌落计数，仅用于活细胞的检测。
性培养基可检测特殊的微生物类群；测定大肠菌群数量的方法。
MPN的缺点：需要大量的玻璃器皿（特别是5试管实验）；不能观 察微生物菌落的形态；准确性不高。
检验结果：用每100mL（g）样品中大肠菌群最近似数来表示，
简称大肠菌群MPN.
（五）染色还原计数法
一种估计活性微生物数量的方法。 原理： 活细胞内含有还原酶，可把 特定的染料从一种颜色还原为另外一 种颜色。
2、稀释
9ml 1 ml
1 ml
9ml
9ml
1 1mml l
9ml 11mml l
1ml
1ml 1ml
1ml
3、倾注平板： 稀释液移入平皿后，将46 ℃~的营养琼脂培养基注入平皿 约15mL,转动平皿。
空白对照
4、倒置 培养
琼脂凝固后，翻转平板 细菌 37 ℃ 48h~ 霉菌 2 8℃ 5天 5、菌落计数法
❖ （5）肉及肉制品样品采集： ❖ 肉类包括鲜肉、冻肉、肉馅、禽肉等，肉制品
指火腿、香肠等。 ❖ 生肉：宰后用无菌刀取两腿内侧肌肉各500克或劈
半后两侧背最长肌各50克，立即送检。 ❖ 家禽：用灭菌棉拭采胸腹各10cm2，背10cm2，
四边各5cm2 ❖ 其他熟制品：一般采200克。
❖ （6）调味品样品采集：
（3）菌落数的报告：100以内时， 按实数报告；
大于100时，两位有效数字如：16400 报告为1.64×104
（二）旋转接种法（Spiral plate method）
原理：接种针将样品液以螺旋方式从平板中央往外连续接种。 接种量：0.05mL
优点：可测定50~500000cfu/mL的菌数；样品不需事先稀释；不 需做2个重复；接种速度快；结果可人工计数，也可用激光计数 器计数；人力与物力花费成本低廉；测定结果与传统方法相关性
大样 一整批样品 中样 200g 小样 分析的样品（检样）25g（ml)
4、采样方法： 无菌操作 采样用具必须无菌 尽量采集有包装的食品； 粉末状样品 边取样边混合 液体样品 边振摇边混合 冷冻食品 保持冷冻状态 非冷冻食品 保存在0~5 ℃
5、采样数量和部位： 200g/件
乳制品 一瓶（个、罐、听）
6、采样标签：名称 来源 数量 编号 时间.. 7、送检 从采样到实验室越快越好，不得超过3h。
二、 检测方法
（一） 传统的SPC方法
标准平板计数法（Standard plate count, SPC）、平板菌落计数法 意义： 判定食品被微生物污染的程度及卫生质量，也可观察微生物在食品中生
长繁殖的动态。
一定量的食品（0. 1mL）
涂布于载玻片（1cm2）上
烘干、固定、脱脂、染色
显微镜计数，用镜台测微尺 计算出视野面积
则 每ml原样液含菌数
❖ =视野中平均菌数× 涂布面积/视野面积×100 ×稀释倍数
DMC方法的优点： 快捷 、简便； 能对细胞形态进行分析； 载玻片易保存，作参考； 可使用荧光技术增强效果。 缺点：仅适于检含大量菌体的样品；准 确性差；易造成操作人员的疲劳。
❖ 酱油、食醋：瓶装 采取1瓶
❖
散装 无菌吸500ml
❖ 酱类 用灭菌勺子取500g
❖ 味精 采取一袋100g
❖ （7）冷食品样品采集： ❖ 冷食菜：将样品混匀，采样200g ❖ 瓶装饮料：两瓶为一件 散装采500ml ❖ 冰淇凌：4杯为一件 散装采200g，放瓶内冷
藏或隔热容器中 ❖ 食用冰块：食用冰块取500g
（七）棉拭子涂抹法
适于食品、 公共场所表层微生物的检测： 1）无菌棉拭子蘸取灭菌生理盐水（10mL试管）均匀涂 抹样品表面一定面积（5cmX5cm，1cmX1cm）后，放 回试管中，及时送检；
2）试管振荡，使微生物悬浮于稀释液中；
3）按SPC方法进行梯度稀释、培养、计数。
第四十讲 食品中微生物数量检测
食品中微生物数量的检测方法
1）标准平板计数法Standard plate count, SPC） 2）最近似数测定法（most probable number,MPN） 3）染色还原技术估算具有还原能力的各种细胞的总数 4）显微镜直接计数法（DMC）
一、样品采集
采样：指从待检物中采取少量具代表性的样品供分析检验用。 1、采样要求 ❖ （1）采样前，准备好灭菌的容器及采样工具； ❖ （2）无菌采样； ❖ （3）用无菌纸袋或玻璃器皿存放样品； ❖ （4）样品及时封口，并做好记录； ❖ （5）及时送检。越快越好，一般不得超过3h。 2、采样原则： 代表性 防止污染 3、采样的种类：
❖ 散装或大型包装：用灭菌刀、勺取样，每件不少于 200g，及时送检。 ❖ 大型包装：采用整件原包装，每件样品采集量为瓶装 ：1瓶 袋装：1袋 罐装：1罐
❖ （4）蛋及蛋制品样品采集：
❖ 鲜蛋：用流水冲洗外壳，再用95%酒精棉球涂擦 消毒后，放入灭菌袋内，加封作好标记送检。
❖ 全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片：将包装开口处用75% 酒精棉球消毒再开盖，用灭菌的金属制双层螺旋 式套管采样器斜角插入箱底，使套管旋转收取检 样，提出箱外用灭菌小匙自上、中、下部取样， 装入灭菌广口瓶中，每个检样不少于100克。