产淀粉酶菌株的初筛 称取窖泥１ ｇ，放入盛有９９ ｍＬ灭菌分离培养基的
三角烧瓶中，静止培养２４ ｈ，吸取富集菌液０．５ ｍＬ，进
行不同浓度梯度稀释，分别取０．１ ｍＬ涂布于分离培养基
口．淀粉酶和葡萄糖淀粉酶将其水解为可发酵的糖类。淀 粉脱支酶同仅．淀粉酶和∥．淀粉酶等水解酶不同，其作用
对象为ａ．１，６．糖苷键，但它不能直接降解淀粉，只有当 ６【．淀粉酶作用后才降解支链淀粉口９１。因此在白酒发酵过 程中，只有在４种酶的共同作用下，才能使谷物中的直链 和支链淀粉更好地被降解，从而提高出酒率。 本实验选取东北寒区优质老窖窖泥，利用五点取样
用于白酒大曲的强化和处理酒糟；谢建华等【１４１从南宁酒 厂附近土壤中筛选到一株产淀粉酶的野生菌株ＧＸＢＡ－４， 经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏ蛔ｕｅｆａｃｉｅｎ）； Ｒｏｈｂａｎ等¨习在伊朗高盐度湖泊中分离出４９个极端嗜盐 微生物，可产淀粉酶和蛋白酶等多种酶，并且鉴定了菌
属；Ｎｏｒａｓｈｉｒｅｎｅ【ｌ卅从马来西亚温泉中筛选出１１株产淀
酶、糖化酶、脱支酶）的细菌，以期筛选生产４种酶活性
测定初筛菌株的淀粉酶活力进行复筛。用发酵培养
基对目的菌株进行培养，分别测定仅．淀粉酶、声．淀粉酶、 糖化酶和脱支酶的活力。 脱支酶活力单位定义为在４５℃、ｐＨ ６．８条件下，
１
均较高的菌株，并对筛选出的菌株进行鉴定。细菌产４种 淀粉酶的调控基因不同口∞８｜３０】，其水解机制也不相同，但
文献标志码：Ａ
文章编号：１００２．６６３０（２０１５）１１－０１７７．０５
白酒是我国传统的发酵食品，因其独特的酿造工艺及 其呈现的特殊风味，在世界酒类产品中别具一格【”。在传
统固态浓香型白酒发酵中，窖泥是白酒风味形成的基础，
用于烧酒制各中淀粉原料的加工［１ ２１。龙茜萍等【ｌ”从贵州 某酒厂大曲中分离得到一株产糖化酶活力较高的菌株，
１
作用，从而提高白酒发酵的原料利用率和出酒率。
１
ｍｉｎ内水解可溶性淀粉产生ｌ Ｉ＿ｔｍｏｌ还原糖所需的酶量。
材料与方法
４种酶活力均采用３，５．二硝基水杨酸（３，５．ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ＤＮＳ）比色法确定‘１７弦翊。
１．１
材料、试剂与培养基 窖泥来自黑龙江省富裕老窖酒业有限公司的优质老
ａ
ｈｉｇｈ－ ａｎｄ
ｑｕａｌｉｔｙ ｌｉｑｕｏｒ ｐｉｔ ｍｕｄ．Ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ
ａ—ａｍｙｌａｓｅ，ｔ－ａｍｙｌａｓｅ，ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ
ａｓ
ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
ａｍｙｌｏ幻ｕｅｆａｃｉｅｎｓ
ａｎｄ
ｎａｍｅｄ
ＭＳＰｌ ３．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ
ａｎｄ ３７℃．Ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ
ａｍｙｌａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ｔｏ
ｂｅ ０．１５
ｇ甩ＣａＣｌ２，０．３舡ＭｇＳ０４‘７Ｈ２０，ｐＨ ５．５
１．６４５％ｏｎ
ａｖｅｒａｇｅ．
分离筛选得到一株高产糖化酶的黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）。近几年许多学者分别从富含淀粉的土壤样品、 海洋泥中和污水排放口处的土样中，都筛选出产淀粉酶 的菌株，并对其进行了鉴定”昏”Ｊ。
３年起，日本研究者三田利用白曲霉
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎ西ｄｕｓ Ｌｉｎｋ）生产出一种酸性淀粉酶，适
表２
Ｔａｂｌｅ ２
ｒＤＮＡ片段的测序与系统发育分析
菌株ＭＳＰｌ３的形态特征
将ＰＣＲ产物送至生工生物工程（上海）股份有限公 司进行序列测定。再将测序所得到的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列与 ＧｅｎＢａｎｋ数据库进行ＢＬＡＳＴ比对分析，通过ＭＥＧＡ软件 构建系统发育树。
１．３．６ 名称
ＭＳＰｌ３
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＭＳＰｌ３ 光滑 裙皱 湿度 湿润 边缘 整齐 革兰氏染色 阳性 菌形 杆状 芽孢着生位置 中
１．３．４
菌株形态学及生理生化鉴定 参照《伯杰细菌鉴定手册》ｐ引，对筛选出高淀粉酶
窖池。
ＤＬｌ ５０００ ＤＮＡ
活力的菌株进行形态学描述和生理生化鉴定。生理生化
Ｍａｒｋｅｒ、细菌基因组ＤＮＡ试剂盒
鉴定包括：甲基红实验、乙酰甲基甲醇实验、柠檬酸盐
利用实验、多种糖发酵实验、好氧性实验、明胶液化实 验、脲酶实验、蛋白胨水解实验、硫化氢实验、硝酸盐
ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｙ ３
Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：ａｍｙｌａｓｅ；ｌｉｑｕｏｒ ｐｉｔ
ｍｕｄ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｌｉｑｕｏｒ
中图分类号：Ｑ８１５
ｄｏｉ：１０．７５０６／ｓｐｋｘｌ００２—６６３０．２０１５ ｌ １０３４
品酶、多糖和抗生素等的主要发酵微生物【ｌ”。在白酒生产 中，淀粉酶起着液化和糖化的作用，是白酒出酒率的重要 保证。因此通过筛选窖泥中高活力淀粉酶菌株，并应用于 白酒发酵，将会明显提高白酒的出酒率。
从ｌ
９ ６
粉酶的嗜热菌，经鉴定这些菌株为分枝杆菌属。张文
丽等【Ｉ刀从吉林某豆制品加工厂污水排放口处的土样中，
鉴定该菌株为黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ），该菌株可应
长期的工艺操作使窖泥富集了种类繁多、功能各异的益于 酿酒的微生物菌群【２｛】。中国浓香型白酒的生产基础是泥 窖窖池，窖泥中的微生物在发酵过程中起着举足轻重的作
用【９ｌ。要产好酒，就必须有优质的窖池，而优质的窖池其 本质在于窖泥，优质的窖泥能产生香气，可大幅度提高白 酒的档次（１ ｏ】。窖泥中多种霉菌、酵母菌和 蛋白胨１０
ｐＨ
哈尔滨宝信生物科技有限公司。
ｇ、 ０００ ｍＬ，
分离和保藏培养基：可溶性淀粉２ ｇ、牛肉膏３
ｇ、ＮａＣｌ ５
还原实验和过氧化氢实验等，每个实验重复３次ｍ’３ ９１。
１．３．５ １．３．５．１ １ ６Ｓ
ｇ、琼Ｊ］旨２０ ｇ、蒸馏水１ ７．０～７．２，固体加入１５～２０ ｇ琼脂，１２１℃灭菌２０ ｍｉｎ。 ｇ、ＭｇＳ０４・７Ｈ２０
※生物工程
艮晶科学
２０１５，Ｖ０１．３６，Ｎｏ．１１
１７７
淀懈生菌懈Ｐ１３筛选及其产酶条件初步优化
马晓梅，赵辉木
（黑龙江大学生命科学学院，农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江哈尔滨
１５００８０）
摘要：从优质白酒窖泥中分离筛选出１３株产淀粉酶的兼性厌氧细菌，通过测定口．淀粉酶、口．淀粉酶、糖化酶和 脱支酶酶活力，最终筛选出一株生产４种淀粉酶活力均相对较高的菌株，并对其进行形态观察，生理生化指标和
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅ—Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓ位ａｉｎ
５．５和温度３７℃。优化后的菌
ＭＳＰｌ３
ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ＭＡ Ｘｉａｏｍｅｉ，ＺＨＡＯ Ｈｕｉ丰 （Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ
４种酶在最适温度、最适ｐＨ值及对金属离子的需求上有 很大相似之处ｐ“３４］，因此优化最适的酶活性条件，以期提 高４种淀粉酶的活力，使４种酶在一个最适的条件下协同
ｍｉｎ内水解支链淀粉产生１／ａｍｏｌ还原糖所需的酶量；
ａ．淀酚酶与声．淀粉酶活力单位定义为在４０℃、ｐＨ ５．６条
件下，１ ｍｉｎ陕］水解可溶性淀粉产生ｌ“ｍｏｌ还原糖所需的 酶量；糖化酶活力单位定义为在３０℃、ｐＨ ４．６条件下，
１６Ｓ
ｒＤＮＡ鉴定，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，并将其命名为ＭＳＰｌ３。对菌株ＭＳＰｌ３产酶条件进行初步优化，确
ｇ／Ｌ，ｐＨ
定其产酶的较佳条件是：ＣａＣｌ２质量浓度０．１５ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ．・７Ｈ２０质量浓度０．３ 株ＭＳＰｌ３生产４种酶的酶活力平均提高了３１．６４５％。 关键词：淀粉酶：窖泥；鉴定：筛选：白酒
５＇－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ一３’；反向引物１５１２Ｒ：
菌２０ｍｉｎ。
１．２
仪器与设备 聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ
ＰＣＲ扩增反应体系和程序
ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）仪 上海精密科
德国Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司；ＤＧＧＥ电泳仪 学仪器有限公司。
１．３ １．３．１
美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司；
０．５
ｍｉｎ，５６℃退火１ ｍｉｎ，７２℃延伸２ ｍｉｎ，３２个循环，
依据生态学原理，采用五点法对酒厂的优质窖池中
７２℃终延ｆ，８ ｍｉｎ，４℃保存。
万方数据
※生物工程
１．３．５．３
良晶科学
２．２ ２．２．１
２０１５，ＶｏＬ３６，Ｎｏ．１ｌ
１７９
目的片段与载体连接
菌株的鉴定 筛选菌株的形态学观察及生理生化鉴定 对菌株ＭＳＰｌ３进行形态学观察和生理生化鉴定，结
１．３．２
粉链的吐．１，４糖苷键，产物为小分子糖和短链糊精的
混合物［２ ６１。口．淀粉酶是外切型水解酶，能从淀粉链的非 还原性末端顺次切下一分子麦芽糖口”。葡萄糖淀粉酶也 是一种外切型水解酶，它从淀粉链的非还原末端顺序切 开ａ．１，４．糖苷键生成一分子葡萄糖旺”。因此ａ．淀粉酶为 伊淀粉酶和葡萄糖淀粉酶提供充足的淀粉链非还原末端，