文献：银耳孢糖的化学结构初步研究及其免疫活性112 分离纯化银耳孢糖1 kg ,加水配成5 %的溶液,充分搅拌,离心(3 000 r·min - 1 ) ,除去色素等杂质,离心(1 000 r·min - 1) ,离心液搅拌下加乙醇至60 % ,离心,离心液加乙醇至醇浓度为80 % ,离心,收集沉淀,干燥,即得粗多糖100 g。

取粗多糖10 g ,加水溶解,经DEAE2Sephadex2A 50 离子交换柱,依次用蒸馏水、012 mol·L - 1 、014 mol·L - 1 、018 mol·L - 1 、2 mol·L - 1 NaCL 溶液洗脱,分别收集各洗脱液,透析,干燥。

将012 mol·L - 1部分称为TSP22。

对TSP22 经Sephadex G2150 进一步纯化,分别得到TSP22a～TSP22c 。

11211 纯度鉴定及分子量测定采用标准葡聚糖Dextran T 系列在下述色谱条件下制作标准曲线,然后测定TSP22a～TSP22c 在相同色谱条件下的色谱图及保留时间,从标准曲线上求出各多糖的分子量,此过程由GPC 软件完成。

流动相为017 %的硫酸钠,流速为015 mL·min - 1 ,柱温30 ±011 ℃。

11212 理化性质及组成糖分析[2 ]1121211 理化性质测定总糖含量以酚- 硫酸法测定,糖醛酸以间羟基联苯方法测定,蛋白质含量以lowry 法测定。

1121212 组成糖分析取TSP22a～TSP22c 各10mg ,加2 mol ·L - 1 三氟乙酸1 mL ,溶解,密封,于121 ℃烘箱中水解115 h ,吹干,残渣加1 mL 甲醇吹干,反复3 次,加水015 mL 溶解,加硼氢化钠20mg ,室温放置115 h ,不时振荡,滴加醋酸至无气泡产生,吹干。

残渣加10 %醋酸甲醇溶液1 mL ,吹干,反复3 次,残渣置五氧化二磷真空干燥器中过夜。

残渣加吡啶015 mL , 醋酐1 mL , 密封, 置121 ℃烘箱中3 h ,放至室温,吹干。

加3 mL 水使溶解,用氯仿萃取3 次,氯仿层吹干,作为中性糖供试品溶液, 进行GC 检测。

酸性糖的还原, 将TSP22a～TSP22c 水解后吹干,置真空干燥箱80 ℃减压干燥2 h ,置五氧化二磷真空干燥器中过夜使成内酯后,再加硼氢化钠还原,以下操作同中性糖部分。

样品进行GC 检测,与标准糖醇衍生物对比,确定单糖的种类。

11213 甲基化分析取TSP22a～TSP22c 各20 mg ,第一部分甲基化按文献[3 ] 进行,衍生物通过GC2MS 检测。

第二部分取少量第一部分甲基化样品,加氘代四氢铝锂还原液[4 ] ,充氮气,密封,80 ℃水浴回流16 h ,放至室温,滴加稀盐酸至无气泡,反应液充氮气离心,取上清液吹干,按组成糖分析方法制备乙酰化衍生物,通过GC2MS 检测,确定糖苷键连接位置。

11214 放射免疫法定量细胞因子放射免疫试管一套,每份设3 副平行管,第一天,每支试管中加入100μl 不同浓度的标准细胞因子和TSP22、TSP22a～TSP22c ,并加入100μl 细胞因子抗体,最后加入300μl 013 %正常家兔血清,振荡。

第二天每支试管加入100μl 125 I 标记的细胞因子。

第三天每支试管中加入700μl 含6 % PEG和2 %放射免疫缓冲液,待反应完全后,离心,弃去上清,放置过夜。

测定沉淀物的放射性, 从标准曲线上查出TSP22 和TSP22a～TSP22c 的细胞因子含量。

2 结果与讨论银耳孢糖经离子交换、凝胶色谱法分离纯化得到TSP22a～TSP22c ,并对其进行纯度分析及分子量测定。

Sepharose CL26B 柱层析表明, TSP22a ～TSP22c 均为单峰;HPGPC 分析的结果表明,TSP22a～TSP22c 均为单一对称峰,表明他们为均一多糖。

用标准葡聚糖Dextran T 系列制作校正曲线。

测得TSP22a～TSP22c 分子量分别为1 100 kD、500 kD、400 kD。

IR 光谱中,3 组分在1733 cm- 1处的肩峰为C = O 的伸缩振动产生的吸收峰,提示可能都含有糖醛酸。

并在810 及870 cm- 1处均出现甘露糖的特征吸收峰,表明含有甘露糖。

组成糖分析结果表明,TSP22a～TSP22c 是由岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖4 种糖组成。

还原后的TSP22a～TSP22c 重新进行组成糖分析,结果表明,还原后的TSP22a～TSP22c 组成糖没有变化,但各单糖残基的摩尔比发生了变化,其中葡萄糖的含量明显增加,结合GC 及IR 光谱分析,TSP22a～TSP22c 中应含有葡萄糖醛酸。

其还原前后的摩尔百分比见表1。

3 种均一多糖的总糖、糖醛酸、蛋白质的含量见表2。

甲基化分两部分进行,第一部分确定中性糖部分糖苷键的连接方式。

第二部分确定糖醛酸的连接方式。

TSP22a～TSP22c 经2 次甲基化后, IR谱检测,300023600cm21处的羟基峰基本消失,相反2 900 cm- 1处的甲基特征吸收峰显著增大,表明甲基化已完全。

第一部分取少量完全甲基化样品,经水解、还原、乙酰化制备成部分甲基化部分乙酰化衍生物,GC2MS 分析以确定中性糖部分糖苷键的连接方式,结果见表3。

3 种多糖均以(1 →3)2D2Man 为主链, 部分Man 以非还原形式处于末端(terminal) 。

并含有大量的分枝,主要在22O2 , 42O2 ,2 ,42di2O2分枝。

在TSP22a～TSP22c 中,Fuc (p)及部分Xyl (p) 以非还原形式存在于terminal 。

第二部分取完全甲基化以后剩余的样品经还原液(氘代四氢铝锂) 还原糖醛酸后借助IR 光谱分析,结果显示在1 728 cm- 1处的C = O 吸收峰消失,说明糖醛酸的羧基已被还原,经水解、还原、乙酰化制备成部分甲基化部分乙酰化衍生物。

还原后的TSP22a～TSP22c 在MS 的碎片峰出现氘代的特征碎片101、117、129、161、191、235。

此结果应是1 ,5 ,62三乙酰基2 ,3 ,42三甲基葡萄糖26 ,62d2的峰,此峰在还原前的GC2MS 图中没有出现,进一步证明了葡萄糖醛酸位于非还原末端。

结果见表3。

TSP22、TSP22a～TSP22c 对细胞因子的影响结果见表4 ,各组分在不同程度上都能刺激人外周单核细胞产生IL21α、IL26 和IL28 的数量增加,且呈剂量依赖性,与阳性对照LPS 相比,TSP22 和TSP22a～TSP22c 高剂量组的刺激作用要明显高于LPS。

表明它们均可不同程度地促进细胞因子分泌,并显示出活性的强弱与分子量大小无关。

文献：银耳多糖的提取及其清除自由基作用银耳多糖的精制将以上得到的银耳粗多糖加水溶解成接近饱和状态, 以8000 转/分离心30 分钟去除少量不溶物. 再次醇析, 可提高多糖的纯度. 也可分级加入乙醇, 既可纯化多糖又可使不同分子量和性质的多糖达到进一步分离目的. 去除杂蛋白、色素按表1步骤操作.将去除杂蛋白、色素的多糖溶液装入预先处理好的透析袋, 先用自来水透析24 小时, 再用蒸馏水透析12小时, 然后醇析, 干燥备用.文献：银耳多糖结构与生物活性研究进展1 银耳多糖结构特征银耳多糖是以α-(1 → 3)-D- 甘露糖为主链的杂多糖，在子实体、孢子、发酵液和细胞壁中都有存在，其组成单糖有葡萄糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖和葡萄糖醛酸，目前研究较多的是子实体和孢子多糖，且主要侧重于单糖组成、相对分子质量和支链等方面的研究。

1.1 子实体多糖1.1.1 子实体酸性杂多糖酸性杂多糖中含有特征性葡萄糖醛酸残基，多种单糖以不同物质的量比存在，多糖相对分子质量大小不一，支链与主链甘露糖的C2、C4 或C6 相连。

首先从银耳子实体的水提取物中分离到3 种具有抗肿瘤作用的酸性杂多糖A 、B 、C ，主要由木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸组成，含有少量的葡萄糖、微量岩藻糖。

A 、B 均含有O- 乙酰基结构，多糖B 相对分子质量为4.7 ×10 5，木糖、葡萄糖醛酸、甘露糖(含少量葡萄糖)物质的量比为1.5:1:3.7[2]。

后来，Ukai 等[3]在证明子实体中酸性杂多糖AC、BC 结构的过程中，用硫酸水解法得到3 种均质的酸性低聚糖(H-1、H-2 和H-3)。

20 世纪80 年代，中国学者夏尔宁等[4]从银耳子实体中提取一种相对分子质量为1.15 ×105 的多糖，是由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成，其物质的量比为0.92:0.49:0.18:1.00:1.15:0.57，其中总糖含量为75.7%，葡萄糖醛酸含量14.7%。

Gao等[5-7]从银耳子实体中提取多种酸性多糖T1a-T1c、T2a-T2d、T3a-T3d，相对分子质量大小不等，均是以(1 →3 ) - 甘露糖为主链，葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖和葡萄糖醛酸组成的支链通过O-2、O-4 或O-6 连接在主链上。

银耳子实体酸性多糖高级结构也有研究，Yui 等[8]提取的多糖一级结构是以α-D- 甘露糖为主链，β-D- 木糖、β-D- 葡萄糖酸、β-D- 木二糖与主链甘露糖的C2连接的，主链具有左旋三重螺旋对称结构，6 个甘露糖残基及3 个侧链基团沿中心轴2.42nm 形成一个重复单位。

1.1.2 子实体中性杂多糖从银耳子实体中分离出的一种碱溶性中性杂多糖为无色粉末，其相对分子质量为8000，聚合度46，主要由木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，物质的量比大约为2:4:5:35[9]。

1.2 孢子多糖银耳孢子可以通过固体培养或深层液体发酵培养获得，孢子多糖结构特点与子实体多糖极其相似。

1.2.1 孢子酸性杂多糖从固体培养法获得的中国福建产银耳孢子中提取、分离得到3 种均一体多糖，分别命名为TF-A、TF-B、TF-C，相对分子质量分别为7 . 6 × 1 0 4、7 . 6 × 1 0 4、7.0 × 104。

TF-A 由L- 岩藻糖、L- 阿拉伯糖、D- 木糖、D- 甘露糖、D- 半乳糖和D- 葡萄糖组成，其物质的量比是0.29:0.037:0.33:1.0:0.75:1.06。

TF-B 和TF-C 由L- 岩藻糖、L- 阿拉伯糖、D- 木糖、D- 甘露糖、D- 葡萄糖和葡萄糖醛酸组成，物质的量比为0.73:0.036:0.28:1.0:0.16:0.19和0.75:0.058:0.37:1.0:0.086:0.37[10]。