三、荧光定量PCR技术的临床应用
二 肿瘤相关基因表达的检测：
1、包括癌基因、抗癌基因
2、肿瘤转移基因
3、转移抑制基因
三、荧光定量PCR技术的临床应用
三 遗传病
1、等位基因检测
2、多基因遗传病的突变检测
3、基因表达异常所致遗传病检测
三、荧光定量PCR技术的临床应用
四 其它应用
1. 法医学鉴定
2. 抗病毒药物疗效的观察、指导
1. 能稳定检测10copy的TB-DNA ，灵敏度高 ，特异性强 2. 早期、快速、准确地诊断结核病。 痰液、肺及支气管灌洗液——肺结核 血液——播散性结核和各脏器的结核病 脑脊液——中枢神经系统结核病 宫颈拭子、尿道拭子——泌尿生殖道结核病
荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
3. 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片 抗酸染色和改良罗氏培养法。 4. TB-DNA浓度可用于判断疗效： 痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 ， TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对 药物治疗及疗效观察提供参考依据
根据分子诊断技术特征划分为三类：
一、基于分子杂交为基础的分子诊断技术 两条同源核酸分子（DNA或RNA）可以在 碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物质 最重要的化学特征，这一过程亦被称为分子 杂交。分子杂交是所有分子生物学技术的基 础，从最初的印迹杂交到聚合酶链反应 （PCR），从基因芯片再到高通量的DNA测序 技术，都离不开碱基互补的分子杂交反应。
分子诊断技术的临床应用
佛山市高明区人民医院检验科 曾钊宇
一、分子诊断的概念
狭义的分子诊断是基于核酸的诊断技术， 是通过对DNA或RNA的检测来实现对疾病的检测 和诊断。但是，随着第一张人类基因组测序图 的完成，以及由此而带来的基因组学、蛋白组 学、代谢物组学等新兴学科的发展，分子诊断 的内涵已经从单纯的DNA/RNA拷贝、突变等变化 的检测，拓展到核酸与DNA片段、蛋白与多肽、 抗原与抗体、受体与配体等生物大分子的检测， 并广泛应用于疾病的筛查、诊断、治疗监测、 预后与预防等生命科学的各个领域。
反 应 指 标
感染
抗体检测临界值 特异性抗体比例
P24+ Ab RNA p24 Ab
时间
婴幼儿感染HIV诊断：12月内核酸检测，13-17月先抗体， 阳性者检测核酸，18个月以上抗体检测
四、PCR检测的标本采集要求
项目 CT NG UU TP HPV 标本采集 男性： 尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道 约2～4厘米，旋转数圈取出分泌物（应 略带粘膜），前列腺液、精液。
3. 缩短诊断的窗口期
窗口期：
PCR检测的临床意义
提供直接证据缩短“窗口期”
项目 HBsAg
ELISA窗口期 项目 50 HBV
NAT窗口期 20-25
抗-HCV 抗-HIV
70 15
HCV HIV
10-14 10
怎样检测HIV早期感染?
血清阳转
血清阳转前的方法
血清阳转后的方法
RNA+ Ab-


常规结核病实验室诊断方法及不足
1. 痰涂片作抗酸染色：阳性率低 、费时 2. 细胞培养“金标准”：周期太长(4-8W) 3. 血清学诊断： a. 接种BCG可出现阳性 b. 不能区分活动性结核病和治愈后留下 损伤灶的病人 c. 交叉反应，假阳性 不能早期诊断！容易漏诊、误诊！
荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
38%
二、PCR概述
（二）原理
双链DNA
（膜板）
变性
退火
延伸
（DNA合成）
（双链分成单链） （膜板与引物杂交）
不断重复
PCR循环次数与DNA产量关系
PCR反应的特点
• 高灵敏度 • 高特异性 • 简便快捷 • 高效扩增、忠实复制！
三、荧光定量PCR技术的临床应用
一 病原体检测

病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测 性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因检 测 优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱 疹病毒（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒（RUB） 其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、 伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等
二、PCR概述
PCR技术能在一个试管内将所要研究的 目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至 十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判 断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细 胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴 定。
PCR 发展简史
1983 Mullis于12月16日成功发明了PCR 1985 关于PCR 的文章首次由 Mullis及其同事等人 在 《Science》杂志上发表 1989 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 10月13日 Mullis获诺贝尔化学奖 1995 荧光定量PCR技术出现 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用
二、基于测序技术为基础的分子诊断技术 DNA的序列分析是分子诊断学的金标准， 各种遗传疾病，病毒或细菌的感染与变异，在 基因表达水平上的个性化用药，多基因疾病的 诊断与预测，最终都可以借助基因测序平台的 应用。
三、基于扩增技术为基础的分子诊断技术 1983年Mullis发明了聚合酶链反应 （Polymerase chain reaction，PCR），使 体外扩增DNA成为可能，开启了体外扩增和操 作DNA或RNA技术的发展。到现在，扩增DNA的 技术已经成为分子诊断应用最广的技术之一， 并发展变化了数十种核酸扩增检测技术。
于临床检测
PCR技术

PCR核心技术是从水栖高温菌中 分离到能耐高温的Taq酶，使从而实现了自动化，使应用领 域迅速扩大，PCR技术成为了分子生 物学中的一项突破性技术。
PCR概述——2000至2013年发表论文1280748篇
30%
32%
PCR＋遗传分析 PCR＋临床诊断 PCR＋肿瘤研究
二、PCR概述
（一）PCR概念
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚
合酶链反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链
DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、
退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链DNA的过程。是一项体外核酸扩增技 术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。