nuclei by DAPI (blue).
共培养条件诱导内皮细 胞迁移
MTLn3： GFP-expressing rat mammary adenocarcinoma cells (乳腺癌细胞) U87MG： GFP-expressing human glioblastoma cell line （胶质瘤细胞） 10T ½： Mouse smooth muscle precursor cells （平滑 肌祖细胞）Cells were stained for actin by Rhodamine-phalloidin (yellow) and nuclei by DAPI (blue). HMVEC （内皮细胞）were stained for vWF(green) to distinguish them from 10T 1/2.
一、细胞增殖(proliferation)动力学检测方法 二、细胞凋亡(apoptosis)检测技术 三、细胞侵袭/迁移(invasion/migration)检测技术 四、细胞生物力学特性(biomechanics)检测技术
一、细胞增殖动力学检测方法
培养中，细胞的生长、繁殖(proliferation)和死亡(death)是一个动
一、细胞增殖动力学检测方法
XTT法原理：XTT是异种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱 氢酶还原成水溶性的棕色(brown)甲肷产物，当XTT与电子耦合剂（PMS） 共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。 MTS法原理：与MTT法原理类似。MTS是MTT的类似物，能被活细胞线粒 体中脱氢酶还原成可溶于水的有色产物甲臜盐，可直接进行比色。特点： 步骤相对MTT更简单，相对更准确。 WST-1法原理：与MTS原理类似。检测范围宽于MTT和MTS。 CCK8法原理：基于WST-8。在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体 内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞 的增殖成正比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞 数量。
四、细胞生物力学特性检测技术
原理：采用微管吸吮方法捕获表征特异性相互作用分子的细胞或小球，通 过压电晶体驱动器操控微管，实现两细胞或小球间靠近-接触-回拉的动力 学循环，并记录回拉过程中细胞变形与否、变形大小和解离时间长短等信
息来研究分子间相互作用(interaction between molecules)的动力学性质。
BrdU掺入法根据选择抗体标记物的不同， 还可以通过免疫组化(IHC)、流式细胞术 (FACS)、ELISA检测细胞的增殖情况。 同类方法：EdU法
Anti-Brdu DAPI
一、细胞增殖动力学检测方法
单个细胞在体外持续生长，其后代所形成的细胞群称为克隆或集落。 该方法可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，也常用来确定抗癌药物 对肿瘤的杀伤能力。常用的方法包括平板集落形成实验（贴壁细胞） 和软琼脂集落形成实验（悬浮细胞）。
四、细胞生物力学特性检测技术
光是一种特殊的物质，携带有能量和动量，光与物质相互作用时彼 此交换能量和动量，产生各种效应。捕获微小粒子的光镊是一个特 别的光场，这个光场与物体相互作用时，物体整个受到光的作用从 而达到被钳的效果，然后可以通过移动光束来实现迁移物体的目的。
光镊可以捕获和操控几十纳米到 几十微米大小的粒子(optical tweezer can capture particles with diameters of dozens of nanometer/micrometer )，它还可 以作为微小力的探针，测量皮牛 亚皮牛量级的力，正好可以用来 研究生物细胞的力学行为，以及 细胞与生物大分子如蛋白质等的 相互作用等，进而从单细胞、单 分子层次上揭示细胞生命活动的 基本规律。
control
0.1 μg /ml
0.5 μg /ml
1 .0 μg /ml
OPN
三、细胞迁移/侵袭检测技术
划线法又叫做wound healing法，是体外模拟体内伤痕愈合过程的实验方法。
三、细胞迁移/侵袭检测技术
基底膜(basement membrane)是普遍存在的一种连续的细胞外基质成份构成 的膜性结构，主要含层粘连蛋白(laminin)和胶原(collagen)。局部蛋白质水解 导致基底膜降解有利于肿瘤细胞的穿出。常用的人工基底膜材料为Matrigel。
三、细胞迁移/侵袭检测技术
细胞迁移（migration） 和侵袭（invasion）的概 念最初来自于肿瘤学。 侵袭是指恶性肿瘤细胞 从起源部位沿组织间隙 向周围组织浸润的过程， 其标志是肿瘤细胞突破 基底膜。肿瘤侵袭是肿 瘤细胞与周围间质相互 作用的结果。 细胞侵袭的研究侧重于 细胞与胞外基质（ECM） 的相互作用。
三、细胞迁移/侵袭检测技术
VEGF诱导内皮细胞
迁移
Migrating cells into soft
(pH 7.4) and rigid (pH.
11.0) scaffolds were studied.
Cells were stained for actin by Rhodamine-
phalloidin (yellow) and
CFU-E
CFU-GM
一、细胞增殖动力学检测方法
结晶紫染色 Crystal violet
二、细胞凋亡(apoptosis)检测技术
细胞死亡有两种不同形式，即细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细 胞坏死是由外界因素导致的细胞急速死亡；凋亡是细胞在生理(physiological) 或病理(pathological)条件下由基因(gene)调控的死亡过程。细胞凋亡过程中 膜结构完整(integral membrane)，染色体DNA断裂(DNA fragmentation)，细 胞膜包裹这核碎片形成凋亡小体(apoptosis body)。 凋亡在胚胎发育、成年阶段衰老、病变细胞的清除发挥着重要的作用，也是 研究药物作用机理和进行药物筛选的的重要手段。
优点：是分子生物学和形态学相结合 的方法，并可检测出早期和极少量的 凋亡细胞，灵敏度比DNA Ladder法高。
二、细胞凋亡检测技术
溴化丙锭（propidium iodide, PI）可与细胞内DNA结合，流式细胞术检测到 的PI荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。凋亡细胞由于总DNA量 降低，将于正常G1/G0期细胞群前出现一亚二倍峰，即凋亡细胞群。
优点:可直观观察粘附事件的发生
(directly observe the adhesion
events)，而且每次粘附事件均可控。 局限性:在于通量低、每次只能实现
单一细胞对检测，且由于测试周期
较长、体外难以长时间维持细胞功 能状态的限制，难于获得大样本的 统计数据。
四、细胞生物力学特性检测技术
Long M, 2007, JBC, Two-dimensional Kinetics of P-selectin-PSGL-1 Interactions
(4)集落（克隆）形成实验：测定单个细胞(single cell)增殖能力。
一、细胞增殖动力学检测方法
在培养瓶或孔板中准确接种相同数量的细胞，每天计数(count everyday)，测 出培养瓶或孔板中的细胞总数，持续7天（也可根据需要而定）。细胞接种 量以7天能长满，而不发生接触抑制(contanct inhibition)为度。
电镜观察细胞超微结构
Hoechst33258染色细胞核观察凋亡
二、细胞凋亡检测技术
细胞凋亡最突出的生化特 征是由凋亡引起的核酸内
切酶(endonuclease)的活
化，使染色质核小体 (nucleosome)间连接断裂， DNA裂解为长度为 180~200bp及其倍数的片
段，在琼脂糖凝胶电泳上
呈现DNA梯形电泳图谱。
常用检测方法： 1. 形态观察(morphology) 2. DNA琼脂糖凝胶电泳(electrophoresis) 3. MTT细胞活性检测 4. 流式细胞仪分析(FACS) 5. 原位末端标记（TUNEL）
二、细胞凋亡检测技术
可通过HE染色，Giemsa染色等方法观察凋亡细胞染色质浓缩，凋亡 小体等现象，也可用电镜、荧光显微镜观察细胞凋亡。
二、细胞凋亡检测技术
凋亡细胞染色体DNA的断 裂首先降解为50~300kb 的大片段，然后在核小体 间随机断开，形成 180~200bp的小片段。 脱氧核糖核酸末端转移酶 （TDT）的作用下，生物 素或荧光素标记的dUTP 可以掺入到凋亡细胞双链 或单链DNA的3’-OH端， 通过颜色反应，特异准确 的定位凋亡细胞。
一、细胞增殖动力学检测方法
各种细胞增殖/毒性检测方法的优势比较
一、细胞增殖动力学检测方法
于细胞培养载玻片上进行，定时取出玻片进行固定染色，并观察计 数，也可将数据绘制成曲线。
细胞培养载玻片
骨髓细胞Giemsa染色
细胞分裂过程荧光染色
一、细胞增殖动力学检测方法
5-溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶的衍生物，可以通过与胸腺嘧啶竞争掺 入到S期细胞单链DNA中，再利用抗BrdU单克隆抗体显示增殖细胞核。 通常用DAPI和BrdU荧光染色复染的方法来分析细胞的增殖情况。 BrdU competes with thymine in the synthesis of DNA during proliferation.
0.01cm2×0.01cm=0.1mm3
一、细胞增殖动力学检测方法
MTT（四唑盐）法
酶标仪
摇床
96孔板
原理：活细胞线粒体(mitochondrion)中脱氢酶(dehydrogenase)能将四唑盐 还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臜（formazan)，并沉淀在细胞中。二甲 亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含 的formazan量成正比。用酶标仪(microplate reader)测定OD值即可获得间 接的细胞数量表征。 特点：快速，准确，可一次处理多个样品。由于脱氢酶非细胞数量的直接 表征，常被审稿人诟病。 类似方法：WST、MTS、XTT、CCK8等。