lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，
G. Kohler
杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限 增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。 增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。 因此单克隆抗体技术又称为杂交瘤技 因此单克隆抗体技术又称为杂交瘤技(hybridoma
仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段： 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：
①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在 两种细胞在一起培养，加入病毒， ℃ 细胞膜上，并使两细胞相互凝聚； 细胞膜上，并使两细胞相互凝聚； 病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环， ②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此 ℃ 时需要Ca 最适PH为 时需要 2+和Mg2+，最适 为8.0一8.2； 一 ； ③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； 细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需 ； ④融合成巨大细胞，仍需ATP 。 融合成巨大细胞，仍需
一、动物细胞融合技术
1、病毒诱导融合法（生物法） 病毒诱导融合法（生物法）
•是副粘病毒科的一些病毒，如仙台病毒、副流感病毒和新 是副粘病毒科的一些病毒，如仙台病毒、 的一些病毒 城鸡瘟病毒，其中仙台病毒最常用。 城鸡瘟病毒，其中仙台病毒最常用。 •1962年，日本的冈田善雄(Okada) 发现日本血凝性病毒 1962年 日本的冈田善雄(Okada) 1962 (HVJ)也叫仙台病毒， (HVJ)也叫仙台病毒，引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细 也叫仙台病毒 胞的现象． 胞的现象． •1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融 1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融 1965年英国的Harris 合方面做了大量的工作，并进一步利用这种灭活病毒来诱导 合方面做了大量的工作， 不同种动物细胞间的融合。 不同种动物细胞间的融合。
•仙台病毒诱导融合机理是： 仙台病毒诱导融合机理是： 仙台病毒诱导融合机理是 病毒囊膜上的刺突（ 病毒囊膜上的刺突（具凝血活性何唾液酸 苷酶活性）与细胞膜上糖蛋白起作用， 苷酶活性 ） 与细胞膜上糖蛋白起作用 ， 使 细胞发生凝聚， 细胞发生凝聚 ， 使膜上的蛋白质使脂类分 子重排，打开质膜，导致细胞融合。 子重排，打开质膜，导致细胞融合。
病毒诱导融合法的特点：
优点：对各种动物细胞都适宜；病毒繁殖量大， 优点：对各种动物细胞都适宜；病毒繁殖量大， 易培养。 易培养。 缺点：制备困难、操作复杂、 缺点：制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差 异大、实验的重复性差、融合率很低， 异大、实验的重复性差、融合率很低，另外病毒 可能会对细胞的生命活动产生干扰等。 可能会对细胞的生命活动产生干扰等。 目前，这种方法主要适用于动物细胞融合， 目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于 实验室研究。 实验室研究。
二、杂交瘤技术与单克隆抗体的生产
（一）何谓单克隆抗体？（monoclonal antibody,McAb） 何谓单克隆抗体？ ） • 抗体（Antibody,Ab）：是指能和相应抗原特异性结合的 抗体（ ）：是指能和相应抗原特异性结合的 ）： 具有免疫功能的球蛋白。 具有免疫功能的球蛋白。 • 抗原 抗原(Antigen，Ag)：能启动机体的免疫应答，且能与其免 ， ：能启动机体的免疫应答， 疫应答产物(抗体或免疫效应细胞 特异性结合， 抗体或免疫效应细胞)特异性结合 疫应答产物 抗体或免疫效应细胞 特异性结合，并发生一 系列生物学效应的物质。 系列生物学效应的物质。 • 免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）:是指具有抗体活性的 免疫球蛋白（ ） 是指具有抗体活性的 或化学结构与抗体相似的球蛋白。 或化学结构与抗体相似的球蛋白。 • 抗体和免疫球蛋白的关系：抗体是免疫球蛋白，并非所有 抗体和免疫球蛋白的关系：抗体是免疫球蛋白， 的免疫球蛋白都具有抗体活性。 抗体结构图） 的免疫球蛋白都具有抗体活性。 （抗体结构图） 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。 抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体
technology ）。
C. Milstein
1、免疫小鼠 、
对抗原的要求是纯度越高越好 纯度越高越好， ◇ 对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用 的抗原。主要有细菌性抗原和病毒性抗原。 的抗原。主要有细菌性抗原和病毒性抗原。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALb/c健康小鼠，鼠龄 健康小鼠， ◇ 选择与所用骨髓瘤细胞同源的 健康小鼠 在8～12周，雌雄不限。 ～ 周 雌雄不限。 ◇ 免疫过程和方法因动物、抗原形式、免疫途径不同而异， 免疫过程和方法因动物、抗原形式、免疫途径不同而异， 以获得高效价抗体为最终目的。 以获得高效价抗体为最终目的。 免疫间隔一般2～ 周 ◇ 免疫间隔一般 ～3周。 抗原量同样与抗原强弱有关， 为例， ◇ 抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为 为例 looµg，第二次为 µg，免疫途径第一次可经腹腔注射。 µ ，第二次为50µ ，免疫途径第一次可经腹腔注射。 每次腹腔注射1× 每次腹腔注射 ×l06一1×107。 ×
免 疫 球 蛋 白 的 基 本 结 构
抗原分子表面（ 抗原分子表面（有的在内 部），决定该抗原特异性 ），决定该抗原特异性 的特殊化学基团。 的特殊化学基团。 • 抗原以抗原决定簇与相应 淋巴细胞的抗原受体结合 而激活淋巴细胞引起免疫 应答； 应答； • 抗原与相应抗体的特异性 结合也通过抗原决定簇来 完成 。 • 每一个抗原决定簇，其性 每一个抗原决定簇， 质和空间构型决定着一种 特异性， 特异性，可与一种抗体结 合。一个抗原分子可以有 一种或多种不同的抗原决 定簇
3、电诱导融合
• 同植物原生质体融合
聚乙二醇（ 聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤 ）
（1）将两种不同亲本细胞各 ×l06混匀； ）将两种不同亲本细胞各5× 混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； ）离心沉淀，吸去上清液； 溶液， （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触 ） ％ 溶液 用吸管吹打，使之与细胞接触1 分钟； 分钟； 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； ） 培养液，分别接种5个直径 个直径60mm平皿，每个平皿 平皿， （5）加5ml 培养液，分别接种 个直径 ） 平皿 培养箱中培养。 加培养液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。 ， ℃ 小时后， （6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。 ） 小时后 换成选择培养液筛选杂交细胞。
2、聚乙二醇诱导融合
•
继高国楠(Kao) PEG成功诱导植物原生 继高国楠(Kao) 用PEG成功诱导植物原生
质体融合后，1975年 Potecrvo用该法成功融 质体融合后，1975年，Potecrvo用该法成功融 合动物细胞。该法以其特有的优势迅速取代病 合动物细胞。 毒诱导动物细胞融合。 毒诱导动物细胞融合。
2、脾细胞的制备 、
(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表； (1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表； 引颈处死小鼠 (2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪， 5ml无血清培养液冲洗一次； (2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次； 无菌条件下取出脾脏 无血清培养液冲洗一次 (3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中； (3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中； 把脾脏置于已消毒的90 目不锈钢网或尼龙纱网中 (4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗， (4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗， 在脾中部切开一小口 令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 3ml 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可； 反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可； (5)把细胞悬液注入50ml离心管中， l0一20ml培养液：轻轻吹打数次， (5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中 把细胞悬液注入50ml离心管中 培养液 置5分钟； 分钟； (6)离心(800一1000转 (6)离心(800一1000转／分)计数、备用。 离心(800 计数、备用。
第十一章 动物细胞融合与杂交瘤技术
一、动物细胞融合技术 二、杂交瘤技术与单克隆抗体的生产

一、动物细胞融合技术
•Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞体内自发地 于 年观察到脊椎动物的肿瘤细胞体内自发地 年观察到 融合产生多核的肿瘤细胞 产生多核的肿瘤细胞。 融合产生多核的肿瘤细胞。 •Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤 于 年描述了正常组织、 年描述了正常组织 组织中的多核细胞现象。 组织中的多核细胞现象。 •Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的 于 年观察到天花病人的血液中也有多核的 血细胞存在。 血细胞存在。 •Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液 于 年第一个观察到脊椎动物（ 年第一个观察到脊椎动物 蛙类） 细胞发生融合的过程。 细胞发生融合的过程。
《生物工程总论》 生物工程总论》
之 “细 胞 工 程” 篇
专业： 专业：生物工程 授课人： 授课人：苗永美
讲授内容及学时分配表
第一章 第二章 第三章 第四章 第五章 第六章 第七章 第八章 第九章 第十章 第十一章 第十二章 第十三章 绪论 实验室的组成及无菌操作技术 植物细胞工程的基本原理 植物离体无性快繁和脱毒技术 植物细胞培养及次生物质的生产 原生质体培养和体细胞杂交 植物花粉、 植物花粉、花药及单倍体育种 植物胚胎培养 种质资源的离体保存 动物细胞培养技术 动物细胞融合和杂交瘤技术 动物胚胎工程 动物干细胞技术 2学时 2学时 3学时 2学时 3学时 3学时 2学时 1学时 1学时 3学时 2学时 3学时 2学时