申请代码： C03050402受理部门：收件日期：受理编号：解除保护国家自然科学基金申 请 书资助类别：面上项目亚类说明：自由申请项目附注说明：项目名称：出血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用 申 请 者：沈霖 电话： 027－85726395依托单位：华中科技大学通讯地址：湖北省武汉市航空路13号邮政编码：430030 单位电话：027-********电子邮件：shenlinhb@申报日期： 2005年2月21日国家自然科学基金委员会基本信息姓名沈霖性别男 出生年月1952年12月民族 汉族 学位 学士职称教授主要研究领域中西医结合临床基础研究电话 027－85726395 电子邮件 shenlinhb@ 传真个人网页无工作单位 华中科技大学 /同济医学院 申 请 者 信 息 在研项目批准号名称华中科技大学代 码43007402联系人 张婷姣 电子邮件 kjcjcb@ 依托单位信息电话 027-********网站地址单 位 名 称代 码[在此录入修改]合作单位信息[在此录入修改]项目名称出血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用资助类别 面上项目 亚类说明自由申请项目附注说明申请代码 C03050402:中西医结合临床基础研究基地类别预计研究年限 2006年1月 — 2008年12月 研究属性 应用基础研究项 目 基 本 信 息申请经费26.0000万元摘要项目研究内容和意义简介（限400字）：出血性血小板病是以反复发作性皮肤粘膜出血、月经过多、鼻衄或眼底、球结膜出血为主症，血小板计数正常，但血小板聚集功能存在缺陷的出血性疾病。
其发病因未明，西医药疗效不甚理想。
理论上任何途径的血小板聚集过程都涉及血小板活化，最终归之于血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb／Ⅲa 复合物。
凝血酶在其中占有重要地位。
凝血酶是最强的血小板活化剂。
其活化血小板主要是通过一个G 蛋白偶联七个穿膜区受体和GPⅠb-Ⅺ-Ⅴ两种途径。
新近发现人类血小板表达的PARl 和PAR4受体，激活其中任何一种，都可以诱导血小板活化。
本项目拟采用单克隆抗体、流式细胞仪及分子生物学技术，在受体及分子水平上研究出血性血小板病凝血酶受体功能与活性，以探讨该病的发病机理；在此基础上，运用益气活血方治疗，并重点观察中药对凝血酶受体的影响，为中医药治疗受体性疾病提供临床及理论依据。
关 键 词(用分号分开，最多5个) 出血性血小板病；凝血酶受体；益气活血方第 3 页 版本1.003.094项目组主要成员(国家杰出青年科学基金不填此栏)编号 姓 名 出生年月 性别职 称 学 位 单位名称电话 电子邮件 项目分工每年工作时间（月） 1 沈迪1922-7-1 男 教授 其他 华中科技大学 027-********shendiwh@ 指导研究 6 2 朱闽1957-12-31 女 教授 博士 华中科技大学 027-********mz1988@ 凝血酶受体检测4 3 李蕾1966-1-21 女 主治医师 博士 华中科技大学 027-********lileilei21@ RT-PCR 技术测定6 4 谢晶1965-3-12 男 副教授 博士 华中科技大学 027-********Jingxie9@ 流式细胞仪检测6 5 周丕琪1968-1-3 男 助理研究员硕士 华中科技大学 027-********zhoupiqi@ 免疫印迹实验8 6 杨艳萍1962-6-29 女 副教授 学士 华中科技大学 027-********Yanpingyang@yahoo.co 血小板膜糖蛋白试验 8 7 戴燚1977-11-3 男 博士生 硕士 华中科技大学 027-********daiyifreeman9401@免疫印迹实验8 8 夏远军1978-11-23 男 博士生 硕士 华中科技大学 027-******** yuanjunxia@ 血小板活化实验8 9[在此录入修改]总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 9522说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。
2. 项目组主要成员不包括项目申请者。
经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费 23.7500以下严格按“国家自然科学基金经费管理办法”执行 1.科研业务费3.3000（1）测试/计算/分析费 1.5000血小板聚集、流式细胞仪、血小板活化试验检测 （2）能源/动力费 0.5000水电费（3）会议费/差旅费0.8000重要学术会议支出（4）出版物/文献/信息传播费 0.5000文献查询、论文版面费和印刷费 （5）其它 0.0000 2.实验材料费18.4500（1）原材料/试剂/药品购置费 18.0000单克隆抗体，各种荧光与酶标二抗，PVDF 膜；ECL 显色试剂盒；中药材及制剂 （2）其它 0.4500购买实验耗材 3.仪器设备费 1.0000 （1）购置 0.0000 （2）试制 1.0000制备实验标本 4.实验室改装费 0.00005.协作费1.0000实验标本收集；化验室进行血小板计数、出、凝血时间等常规检测协作费 二.国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 0.00002.境外专家来华合作交流 0.0000三.劳务费 1.0000研究生及博士后人员科研劳务费 四.管理费1.2500按申请金额5％计算 合 计26.0000国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）与本项目相关的 其他经费来源其他经费来源合计0.0000查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容 （4000-8000字）：1. 项目的立项依据出血性血小板病是一组反复发作性出血性疾病。
患者常有轻重不等的肢体瘀斑，月经过多，鼻衄，齿龈出血或眼底、球结膜等出血倾向，血小板计数、血小板形态、出凝血时间及凝血象均属正常，且除外其它原因所致的出血，但血小板聚集功能存在缺陷。
在本病的发病原因及治疗方面虽有不少论点，但其确切的发病机制至今未明；西医药用强的松、氨肽素、安络血及维生素C、P等治疗，疗效也不甚理想。
关于皮肤粘膜出血和月经过多症状与血小板聚集功能缺陷的关系，是我们在临床上研究类似出血性疾病时所见到的。
早在1984年,同济医科大学沈迪等人发现一组血小板计数正常而对刺参粘多糖诱导的血小板聚集反应明显减低或缺如的皮肤粘膜出血或伴月经过多患者，当时称为“新型血小板聚集功能缺陷症”，并经国内部分血液学家的复制和证实。
然而其中有些出血者的血小板被腺苷二磷酸（ADP）、花生四烯酸（AA）、血小板活化因子（PAF）、肾上腺素和胶原等诱导，也可出现血小板聚集缺陷，其缺陷率在752例中约占31.6%，称为“未明原因血小板病”。
这两组出血性血小板病的研究均曾受国家自然科学基金的资助（编号3870716和39370322），研究结果共发表论文40余篇，他人重复试验和证实的发表论文37篇。
90年代初，在湖北省卫生厅资助下，研究组开始运用中医药辩证治疗本病。
本病的出血症状属中医“血证”。
在临床辩证中，发现上述两种血小板病患者中有“气虚”者占78.1%，提示该病中医病机多属“气不摄血证”。
根据中医“活血止血”的理论，经体外筛选及临床摸索，自拟益气活血方治疗本病。
方中黄芪、党参益气，当归活血补血，黄芪、当归含有当归补血汤之意。
赤芍、桃仁活血化瘀，甘草和中。
经临床验证467例，中药组在控制出血，改善气虚症状，对血小板聚集缺陷的纠正及停药1年后复发率等疗效方面均明显优于西药氨肽素、安络血、维生素C、P对照组。
但其确切的药理作用有待深入研究。
2002年本项研究继续获得国家自然科学基金资助（项目批准号30171194），重点研究了出血性血小板病膜糖蛋白受体变化及中药对其的影响。
归纳研究的重点内容：ELISA检测膜糖蛋白（ Membrane Glycoprateins，GP）Ⅱb、Ⅲa含量减低，洗涤血小板后又可恢复正常范围；流式细胞术测GPⅠb/Ⅸ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb、GPⅢa及p-选择素表达荧光强度均低于正常人（P<0.05）；经中药治疗后，患者的血小板膜糖蛋白表达增加，与正常组比较差异无显著性（P>0.05）而明显优于西药组（P<0.05）。
提示益气活血方在受体蛋白水平上调节血小板膜糖蛋白的表达是其治疗出血性血小板病的疗效机理之一。
值得指出的是，由于GPⅠb为血小板高亲和力凝血酶受体，而我们的研究发现出血性血小板病患者GPⅠb低下，这就进一步启迪我们，该病发病机理可能与凝血酶受体异常有关。
凝血酶是一个多功能血浆丝氨酸蛋白酶，它能活化血小板使之发生聚集。
GPⅠb/ Ⅸ/ Ⅴ复合物是血小板表面的重要膜糖蛋白，能与凝血酶结合，在血小板粘附及聚集过程中起重要作用，长期以来被普遍认为是凝血酶受体。
GPⅠb/ Ⅸ/ Ⅴ包括4种成分：GP Ⅰbα、GPⅠbβ、GP Ⅸ、GPⅤ。
很多资料表明，凝血酶高亲和力结合位点于GPⅠb α，GPⅤ对凝血酶高亲和力结合位点形成有重要作用。
近年来研究发现血小板表面还存在一类重要的凝血酶受体，即PARs (protease-activated receptors)，凝血酶的细胞反应可部分地通过这一个G蛋白偶连受体的小家族介导进行信号传递，这一家族包括PARl、PAR2、PAR3与PAR4四大成员。
通常凝血酶反应由一个以上PARs受体介导，切割其特定位点暴露新的氨基末端，从而形成一个固定配基与受体进行分子内结合，影响跨膜信号传导。
人类血小板表达PARl与PAR4受体，它们都能与G12/13、Gq家族偶连，并通过分泌ADP引起P2Y12受体活化而间接激活Gi信号途径，引起血小板聚集、释放以及膜糖蛋白的一系列改变。
PARl具有高亲和力，低浓度凝血酶即诱导其活化，产生快速、强劲的血小板反应。
PAR4则亲和力较低，作用弱于PARl，由高浓度凝血酶活化，可以成为PARl途径的补充。
PARs受体的研究在国内尚刚起步，而国际上正成为热点。
因此进行凝血酶与血小板相互作用的研究，对于深刻了解出血性疾病的发病机制的机理非常重要。
本项目根据我们十余年来对出血性血小板病研究的初步结果及中医药治疗的疗效，结合国内、外专家理论，认为不论何种诱导剂引起血小板聚集反应的途径如何，其前提是血小板活化，凝血酶是最强的血小板活化剂，其可以调节血小板聚集、释放与内皮细胞活化。
因此研究血小板表面凝血酶受体功能对于出血与止血研究至关重要。
而我们所见的病例中多有GPIb-I复合物含量减低的，故初步推想这类出血性疾病可能是一组凝血酶受体功能异常所致。
而益气活血中药治疗该病的疗效机理之一，可能与调节凝血酶受体存在一定关联。