雷公藤内酯醇人工抗原的合成及多克隆抗体的制备刘晓1¶，唐波1¶，姚其正2，郑伟娟1*，华子春1*1南京大学医药生物技术国家重点实验室，南京(210093)2中国药科大学药学院，南京(210009)E-mail: zchua@摘要: 用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇（Triptolide 14-succinate）和不同的蛋白载体（cBSA，OVA）偶联合成雷公藤内酯醇的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定了偶联效果，计算了偶联率。
利用免疫抗原免疫小鼠，制备了小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析了血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析了抗体特异性，为进一步研究雷公藤内酯醇的分子作用机理以及制备雷公藤内酯醇的单克隆抗体奠定了基础。
关键字: 雷公藤内酯醇，14位羟基修饰，人工抗原，多克隆抗体1. 引言雷公藤内酯醇（Triptolide,简称TP）,分子式C20H24O6，分子结构如图1，分子量360.41，二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。
长期以来，作为临床上公认的免疫抑制剂主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。
近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。
除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。
近年来，国内外对雷公藤内酯醇具有如此广泛的作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。
但是，由于缺少方便快捷的雷公藤内酯醇检测手段，长期以来对雷公藤内酯醇直接作用位点的研究一直十分困难，对雷公藤内酯醇作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。
细胞免疫化学是追踪分子在细胞内的作用过程的有力工具，如果能够得到雷公藤内酯醇的抗体，就为利用细胞免疫化学研究雷公藤内酯醇的作用靶点和在细胞内的定位等创造了分子探针，为最终研究雷公藤内酯醇作用机制和寻找其靶蛋白创造了可能。
作为小分子半抗原，雷公藤内酯醇需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原，为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。
已有的雷公藤内酯醇结构-活性研究显示雷公藤内酯醇的不同生物效应依赖于不同的功能基团。
研究证实，对于12，13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物（雷公藤内酯三醇）会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性。
14位羟基是雷公藤内酯醇最容易被改造修饰的基团，研究表明，14位羟基被改造为水溶性的基团作为前药能极大改善小分子的水溶性，促进体内代谢，降低毒性，甚至能改善雷公藤内酯醇在体内的免疫抑制活性和抗肿瘤活性[1] [2]。
综合考虑，雷公藤内酯醇的14位羟基是最合适的偶联基团。
TP的水溶性不理想，且14位羟基不容易在温和条件下和蛋白载体反应，我们首先对14位羟基进行结构修饰，改造为水溶性的羧基，利用缩合反应偶联改造的牛血清白蛋白（cBSA，氨基化修饰的BSA）和鸡卵清蛋白（OVA），合成TP的免疫抗原TP-cBSA和检测抗原TP-OVA。
用免疫抗原免疫小鼠，顺利得到了雷公藤内酯醇的多抗。
本课题得到基金项目：国家自然科学基金（批准号：30425009,30730030）、江苏省自然科学基金（批准号：BK2007715）资助。
¶对本文同等贡献；*共同通讯作者。
Figure 1 Molecular structure of Triptolide2.实验部分2. 1 试剂和仪器雷公藤内酯醇（triptolide, TP, 购自SIGMA公司）, 改造的牛血清白蛋白（cBSA, 购自PIERCE公司），鸡卵清蛋白（OVA），1- 乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂(FIA)， 6-8周龄BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心,Sephadex凝胶柱（购自PIERCE）岛津UV-2550紫外可见分光光度计， Eppendorf Centrifuge 5415R离心机，TECAN SAFIRE自动酶标仪2. 2 雷公藤内酯醇14位羟基的修饰以及修饰产物的质谱鉴定将TP的14位羟基进行衍生化修饰，在弱碱性条件下和丁二酸酐进行酰化反应，反应式如图2所示，得到水溶性分子triptolide 14-succinate（简称mTP）Triptolide Triptolide 14-succinateigure 2 The derivation reaction from triptolide to triptolide 14-succinate2. 3 雷公藤内酯醇人工抗原的制备碳二亚胺法偶联mTP与蛋白载体（以cBSA为例，OV A合成的方法类似）：取5 mg mTP和2.5 mg cBSA溶解在250 μl TE buffer（pH 8.0）中，充分震荡使其溶解，再取碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）79 mg充分溶解于250 μl TE buffer（pH 8.0）中。
将mTP 和cBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液，在37℃摇床中反应2小时以上。
先用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的mTP小分子，再透析纯化，将0.5 ml 溶液在PBS中透析3天，每天换液两次，每次换液200 ml。
透析产物小剂量分装，于-20℃保存备用。
2. 4 人工合成抗原的紫外鉴定用紫外分光光度法对cBSA标准品、偶联产物和mTP进行紫外扫描，根据偶联产物最大吸收峰的位移判断是否偶联成功。
2. 5 人工合成抗原偶联率的计算紫外扫描结果显示，蛋白载体最大吸收峰的位置在280 nm，mTP最大吸收峰在261 nm，偶联产物这两个波长的紫外吸收强度包括了蛋白载体和mTP的贡献。
人工合成抗原的摩尔偶联率C mTP/C BSA可由以下公式计算得出：C mTP/C BSA=(A280×K BSA, 261－A261×K BSA, 280)/(A261×K mTP, 280－A280×K mTP, 261)其中A280 , A261分别为偶联产物在波长为280nm和261nm时的紫外吸光度，K BSA, 280、K BSA, 261、K mTP, 280、K mTP, 261分别对应BSA和mTP在波长为280nm和261nm的摩尔消光系数[3]。
2. 6 雷公藤内酯醇人工抗原多抗血清的制备及鉴定初次免疫：将100 μg 人工抗原与等体积完全福氏佐剂（FCA）乳化完全，皮下分点注射4只BALB/c小鼠；二次免疫：初次免疫后两周将100 μg 人工抗原与等体积不完全福氏佐剂（FIA）乳化完全，皮下分点注射BALB/c小鼠；三次免疫：两周后将150 μg 人工抗原皮下分点注射BALB/c小鼠；第三次免疫两周后，以200 μg人工抗原经腹腔加强免疫血清效价较高的小鼠。
尾部采血分离抗血清，以制备的检测抗原OV A-mTP包被ELISA板，采用间接ELISA法检测血清抗体的效价。
为了验证血清中雷公藤内酯醇抗体的特异性反应，我们用偶联好的OV A-mTP包被酶标板，再用不同浓度的Triptolide、雷公藤内酯三醇（Triptriolide，图3）和冬凌草甲素（Oridonin）间接竞争ELISA法检测血清中抗体特异性。
竞争ELISA方法如下，以TP为例：取OV A-mTP于37℃，2h包被酶标板（100 μl/孔），10 %羊血清封闭后PBST 洗三次，每孔加入50 μlTP，浓度分别为1、2、5、8、10、30、50 ng/μl和50 μl稀释的血清，混匀后37℃反应1 h，PBST洗三次，加入酶标二抗37℃反应1 h，洗三次，每孔加显色液150 μl，反应15 min，2M硫酸终止反应后，用酶标仪测450 nm吸收值，每孔测四次，取平均值。
建立竞争抑制曲线。
Figure 3 Triptriolide structure.3. 结果和讨论3. 1 mTP的质谱鉴定mTP质谱如图4，分子量为440和540的峰分别对应Triptolide和Triptolide 14-succinate各自与溶剂吡啶形成的离子峰，由丰度可见，衍生化产率较高。
Figure 4 Mass spectrum of Triptolide and its derivative3. 2 TP人工抗原的紫外鉴定和偶联率氨基衍生化后的牛血清白蛋白载体cBSA的氨基数量远多于羧基，一方面能够提高偶联效率，另一方面提高了BSA的等电点，使得蛋白在反应体系的PH下溶解度大大改善。
偶联产物的紫外光谱见图5：偶联产物的最大吸收峰相比蛋白载体向左明显偏移，由280nm到了269 nm左右，显示偶联成功。
偶联产物在280 nm和261 nm的紫外吸光值分别是3.029和3.058，由公式可计算得出mTP和蛋白载体cBSA的摩尔比为65:1，偶联效率较高。
Figure 5 The UV spectrum of cBSA, conjugate and mTP3. 3 多抗血清的效价和抗体特异性反应第三次免疫两周后，用间接ELISA法测定小鼠血清抗体效价为1: 102400，Triptolide、Triptriolide和Oridonin的间接竞争ELISA实验表明，Triptolide及其衍生物Triptriolide均能产生竞争作用，而Oridonin不显示竞争关系，证明血清中多抗能在很大程度上与雷公藤内酯醇及其衍生物雷公藤内酯三醇反应，而完全不能与同为二萜类化合物的冬凌草甲素结合。
与TP 相比，雷公藤内酯三醇仅仅是12，13位的环氧基团打开，其它结构完全一致，能被多抗识别是可以理解的，但从竞争曲线上看来，TP的竞争饱和吸光值要低于雷公藤内酯三醇，从一定程度上证明多抗与雷公藤内酯醇的结合能力强于雷公藤内酯三醇，提示多抗中存在着识别雷公藤内酯醇12，13位环氧基团的特异性抗体。
冬凌草甲素是一种中药提取物，也具有抗肿瘤、消炎止痛等功效，与TP同为二萜类化合物，具有类似的分子量，分子为四环结构，无环氧内酯，冬凌草甲素不能产生竞争作用，证明多抗对雷公藤内酯醇系列分子结构的特异性识别。
以浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，竞争抑制曲线如图6所示。
从雷公藤内酯醇的竞争抑制曲线上看，在0-8 ng/μl的浓度区间内，OD450和TP的浓度呈一定的线性关系，暗示可以通过ELISA方法进行雷公藤内酯醇的定量。