入突变、转座子插入突变等。主要介绍这两种方法的原理及其在水稻功能基因组学研究中的应用和进展，并分析和讨论了插 入突变在水稻功能基因组学研究中存在的困难和发展趋势。 关键词： 插入突变Ｔ－ＤＮＡ转座子 水稻功能基因组学
Ｓｔｕｄｙ
ｏｎ
ｔｈｅ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ
Ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ
Ｓｕ Ｈｏｎ９１・２
１２
ＡｄＤｓ系统插入和逆转录转座子插入法，如Ｔｏｓｌ７插 入建立水稻突变体库…。转座子可通过ＤＮＡ复制 或直接切除两种方式获得可移动片段，重新插入基 因组ＤＮＡ中。根据转座的自主性，这类元件又可分 为自主转座子和非自主转座子，自主转座子本身能 够编码转移酶而进行转座，而非自主转座子只有在 自主转座子存在时才能转座，如Ａｃ／Ｄｓ系统中，Ａｃ 属于自主转座子而Ｄｓ属于非自主转座子。逆转录 转座子是通过ＲＮＡ中间体进行转座的，这类转座子 转座后不需切割，因此能产生永久的突变。逆转录 转座子的主要特征是两端具有长的同向末端重复序 列（１０ｎｇ
ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ），ＬＴＲ主要携带有转录
起始和终止信号及转座所需的调控序列，在正常条 件下它们是失活的。逆转录转座子因其产生的插入 稳定，用于基因标记具有很大的潜力，如Ｔｏｓｌ７反转 录转座子已发展成为一个在水稻上很有希望的体 系。然而相对较低的转座频率限制了它们用于大规 模的基因标记。 Ａｃ／Ｄｓ系统是玉米中的一个转座子家族，广泛 应用于水稻插入突变体构建。Ａｃ因子单独存在便 可引起转座突变，但变异不稳定；Ｄｓ因子在有Ａｃ因 子或合成转座酶的序列存在的条件下才会引起插入 突变。Ａｃ／Ｄｓ因子以非复制的方式转座即所谓“切 粘”机制，但也会在染色单体间发生基因转换，使转 座子拷贝数增多，如水稻花粉育性相关的ａｉｄｌ突 变体‘８｜。 Ｔｏｓｌ７是水稻中第１个被鉴定的最有活性的逆转 录转座子，它在组织培养条件下可以被激活，且随培养 时间的延长其拷贝数会提高。实验表明Ｔｏｓｌ７在正常 繁殖的水稻品种中的拷贝数因随基因型而有所不同， 一般只有ｌ一５个拷贝；在组织培养下其拷贝数随继代 培养时间的延长而较快增加，当培养１６个月以后，其 拷贝数开始保持稳定；一般组织培养可使Ｔｏｓｌ７的拷贝 数增至５～３０，且Ｔｏｓｌ７只在组织培养条件下被激活，再 生植株的Ｔｏｓｌ７仍然是没有活性的一。。
Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：
ｓｏｕｒｃｅｓ
ｋｎｏｗｎ∞ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ
ｃａｎ
ｔｏ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ａ
ｒｉｃｅ
ｍｕｔａｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ
ｔｏ
ｔｈｅ
ｏｆ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｔｈｅ
插入突变在水稻功能基因组学中的应用 和进展
至２００４年，韩国构建了有３０ ０００个水稻Ｔ－
ＤＮＡ插入突变体的突变体库；法国构建有６ ０００多 个水稻Ｔ．ＤＮＡ插入突变体的突变体库，日本Ｓｈｉ—
万方数据
２００９年第５期
苏红等：插入突变在水稻功能基因组学中的研究进展
０００
３
ｍａｍｏｔｏ实验室利用ＡｃｉＤｓ转座子标签已创造６
ｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ
ＰＣＲ）等方法扩增出插入位
点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，结合结构基因 组数据进行更全面的分析。
Ｊｕｎｇ掣１０１筛选叶绿素缺陷的Ｔ．ＤＮＡ突变体，发
现其中一个突变体Ｔ．ＤＮＡ插入的基因与大麦中翮Ⅳ－
ＴＨＡ—Ｆ基因和拟南芥中ＣＨＬＨ基因同源，进一步研究 表明该基因编码叶绿素的四吡咯生物合成途径中的一 个关键酶的大亚基，这是Ｔ—ＤＮＡ突变体用于水稻基因 功能分析的第一次报道。赤霉素２０氧化酶（ＧＡ２００ｘ） 是赤霉素生物合成倒数第二步的关键酶，基因ｏｓ— ＧＡ２００ｘ２作为“绿色革命基因”而闻名，但另一个赤霉 素２０氧化酶基因ＯｓＧＡ２００ｘｌ，由于没有找到合适的突 变体使得它对植物高度的贡献不甚了解。Ｏｉｋａｗａ 等¨¨找到了一个具有高赤霉素过量表型的Ｔ—ＤＮＡ插 入突变体，将含有３个ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的Ｔ－ＤＮＡ插在 ＯｓＧＡ２００ｘｌ开放阅读框的上游，突变体节间长度约是野 生型亲本的两倍。特异抑制ＯｓＧＡ２００ｘｌ的表达导致水 稻最终高度的减少，表明ＯｓＧＡ２００ｘ２和ＯｓＧＡ２００ｘｌ均影 响植物的高度。Ｌｅｅ等¨２１使用Ｔ．ＤＮＡ插入突变体库 对半胱氨酸蛋白酶基因ＯｓＣＰｌ进行了功能分析，ＧＵＳ 检验显示ＯｓＣＰｌ的启动子在水稻花粉囊中有很高活 性。序列分析显示预测的ＯｓＣＰＩ氨基酸序列与木瓜蛋 白酶家族中半胱氨酸蛋白酶含有的保守结构域同源。 在砣代鉴定了一个抑制的突变体，显示出花粉发育的 严重缺陷，表明该基因在水稻中编码半胱氨酸蛋白酶， 可能在花粉发育中起重要作用。Ｌｅｅ等¨３ ３将开花推迟 的Ｔ—ＤＮＡ插入突变体整合在水稻ＯｓＭＡＤＳＳＯ的Ｋ．ｂｏｘ 区域，ＯｓＭＡＤＳＳＯ的超表达引起愈伤阶段的极早开花， ＯｓＭＡＤＳＳＯ的ＲＮＡｉ植株显示出开花延迟和增加伸长
ｉｎ Ｒｉｃｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
Ｙｉｎ Ｌｉｐｉｎ９１
（１Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＬｉ＃Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｐｉｔａｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４８；２Ｂａｏｆｉ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｎｏｊｉ ７２１０１３）
Ｅｎ／ｄＳ
多个水稻突变体，Ｈｉｒｏｃｈｉｋｏ实验室应用逆转座子 Ｔｏｓ－１７也构建了突变体群体，我国的Ｔ—ＤＮＡ插入突 变群体５０ ０００个株系以上¨’。利用Ｔ．ＤＮＡ和转座 子插入突变等构建成插入突变库后，就可利用正向 和反向遗传学方法进行基因功能鉴定。正向遗传学 法可以根据插入序列迅速克隆到突变基因，确定该 基因的功能；反向遗传学法可以根据插入的已知序 列和目的基因序列设计ＰＣＲ反应引物，通过ＰＣＲ 技术从突变体库中筛选出目的基因的插入突变体。 另外，利用反向ＰＣＲ（ｉｎｐａｐｅｒ
ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ Ｔ－ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａ—
ｔｗｏ
ｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓ
ｍａｉｎｌｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅｓｐｅｃｉａｌ－
收稿日期：２００９－０２—１３
Ｔ．ＤＮＡ插入突变 Ｔ．ＤＮＡ是来自根癌农杆菌Ｔｉ质粒，约２０ ｋｂ，包
含冠瘿碱生物合成和冠瘿瘤生长的基因，它能利用其 两端２５ ｂｐ的同向重复序列随机且稳定地整合到植 物基因组中，并稳定表达。关于Ｔ－ＤＮＡ转移和整合 的机制目前尚不完全清楚。Ｔ－ＤＮＡ插入突变具有其 他插入突变方法没有的优点，在转基因植物中一般只 有１～２个拷贝，可以作为突变源引发致变效应。利
基金项目：国家自然科学基金（３０７７０１７８），北京市教委科技发展基金重点项目（ＫＺ２００７１００２８０１３） 作者简介：苏红（１９７４・），女，讲师，研究方向：植物功能基因组学 通讯作者：印莉萍，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｉｎｌｐ＠ｍａｉＬ
ＣＩＩＵ．ｅｄｌＬ
ｃｎ
万方数据
２
生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
２插入突变的分类
２．１
ｌ插入突变与其他突变方法的比较
产生突变体的方法有物理和化学诱变、同源重组 （ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、基因沉默（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｅ） 以及插入突变（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ）等口Ｊ。这些方 法都可以用来构建突变体库，但每种方法都有各自的 优缺点。物理和化学诱变比较容易得到饱和突变体 库，但突变基因的克隆要用较复杂的图位克隆法，难 以在全基因组测序信息的基础上进行基因功能的研
生物技术通报
・综述与专论－ ＢｌｏＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ ２００９年第５期
插入突变在水稻功能基因组学中的研究进展
苏红１・２ 印莉萍１
（１首都师范大学生命科学学院，北京１０００４８；２宝鸡职业技术学院，宝鸡７２１０１３）
擒要：
构建饱和的基因突变体库是最直接、有效的分析鉴定基因功能的方法。根据插入突变源不同可分为Ｔ－ＤＮＡ插
节间的数量。结果表明ＯｓＭＡＤＳＳＯ基因是开花的激活 因子，控制水稻各种花的调节因子。ｕ等¨４。在Ｔ—ＤＮＡ 插入突变体库中筛选到一个具有短根表型的突变体， 并从中分离到水稻谷氨酸受体相似基因，命名为 ＧＬＲ３．Ｊ『。突变体根中分生组织的分裂失常，而且伴随 着强烈的细胞程序性死亡。研究表明ＧＬＲ３．１在早苗 期对于维持根顶端分生组织细胞分裂和细胞的生存是 必须的。Ｊｉａｎｇ等¨纠找到一个在根的伸长中对温度敏 感的Ｔ—ＤＮＡ插入突变体，遗传和分子的分析显示，突 变表型是编码葡萄糖＿６一磷酸乙酰基转移酶的基因仍一 ＧＮＡｌ的功能丧失引起的，该基因与ＵＤＰ—Ｎ一乙酰葡萄 糖胺的重新合成有关。此结果支持了蛋白质的糖基化 在细胞代谢，微管稳定性，水稻根中细胞形态建成中起 重要作用的观点。 ＤＮＡ转座子用于水稻插入突变体库的构建已 有数十年，早期研究主要集中在外源的玉米Ａｃ／Ｄｓ、
究；同源重组是酵母和鼠类中用得比较成功的一种方 法，植物中同源重组率比较低＂ｏ；基因沉默在线虫突 变体库构建中得到成功应用，但并不适合于植物Ｈ。。 对于水稻功能基因鉴定，插入突变与化学或物理诱变 剂等产生的突变相比具有很多优点，该方法利用已知 的插入序列作为标记，不必预先确定基因型和基因产 物即可对未知基因进行研究。因此，插入突变已成为 进行水稻功能基因鉴定的首选方法。
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００９年第５期
用Ｔ—ＤＮＡ插入突变，在拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ） 中已经成功建立了接近饱和的插入突变体库，该突变 体库包含超过２２５ ０００个独立的Ｔ．ＤＮＡ插入株系忙１。 对插入突变体的分析表明，在预测的２９ ４５４个基因中 有２１ ７００个基因发生了插入突变，插入序列随机分布 于整个染色体基因组中，插入内含子和启动子也出现 表型突变。此外，Ｔ—ＤＮＡ在其基因组中的插入位点有 一定的偏向性，偏向插入到基因密度较高的区域、基 因的非翻译区及启动子区，Ｔ．ＤＮＡ插入对特定的基因 类别没有明显的偏向性。自１９９４年Ｈｉｅｉ等”１首次报 道用农杆菌介导的Ｔ—ＤＮＡ法对水稻成功实现遗传转 化以来，该方法在水稻遗传转化中得到广泛应用并不 断完善，这使建立水稻的Ｔ．ＤＮＡ插入突变库成为可 能。水稻中已建立了具有一定规模的Ｔ—ＤＮＡ插入突 变体库，但远没有达到饱和的程度。最大的水稻Ｔ— ＤＮＡ插入突变库包含２９ ４８２插入突变株系，对其中