园艺学报，（）：– 2014411122152224 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@收稿日期：2014–08–22；修回日期：2014–10–24基金项目：河北省海外高层次人才百人计划项目（E2013100011）；河北省杰出青年科学基金项目（C2013204118）；‘十二五’农村领域国家科技计划课题（2012AA100202-5）；农业部农业科研杰出人才培养计划项目（2130106）；高等学校博士学科点专项基金项目（20121302110006）大白菜叶色突变体的HRM 鉴定及其叶绿素荧光参数分析刘梦洋，卢 银，赵建军，王彦华，申书兴*（河北农业大学园艺学院，河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室，河北保定 071000）摘 要：将大白菜经甲基磺酸乙酯（EMS ）诱变种子获得的42株叶色突变体按照生殖时期叶片颜色和叶绿素含量分为9种类型：深绿色、灰绿色、绿色、浅绿色、白绿色、白浅绿色、黄绿色、黄浅绿色、黄色；利用高分辨率熔解曲线（high resolution melting ，HRM ）技术对叶绿素荧光基因HCF164突变进行了筛选并结合叶绿素荧光参数测定，获得了1株黄绿色高光合效率突变体A29，1株黄绿色光合结构损伤突变体A35和1株浅绿色光合电子传递受阻突变体A21；对另外7个叶色相关基因的突变进行了HRM 鉴定，表明叶绿素相关基因ATRCCR 、CLH2、PORA 突变可能是造成18个突变体叶色变化的主要原因，黄叶特异基因家族YLS 突变与叶色变化也有关系。
关键词：大白菜；诱变；突变体叶色；HRM ；叶绿素荧光中图分类号：S 634.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X （2014）11-2215-10HRM Identification and Chlorophyll Fluorescence Characteristics on Leaf Color Mutants in Chinese CabbageLIU Meng-yang ，LU Yin ，ZHAO Jian-jun ，WANG Yan-hua ，and SHEN Shu-xing *（College of Horticulture ，Agricultural University of Hebei ，Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and Utilization of Hebei ，Baoding ，Heibei 071001，China ）Abstract ：Forty-two leaf color mutants of Chinese cabbage obtained through EMS seeds mutagenesis were used as materials in this study. According to leaf color and leaf chlorophyll content at generative growth mutations were suggested to be divided into 9 types ：Dark green ，gray-green ，green ，light green ，white-green ，light white-green ，yellow-green ，light yellow-green and yellow. By detecting the nucleotide variation of the gene HCF164 related to chlorophyll fluorescence using HRM technology and by measuring chlorophyll fluorescence characteristics ，we identified one yellow-green leaf color mutant A29 with high photosynthesis efficiency ，one yellow-green leaf color mutant A35 with photosynthetic structure damages ，one light green mutant A21 with photosynthetic electron transport obstruction. Through identifying other 7 leaf-color-related genes by HRM ，mutation of chlorophyll-related genes ATRCCR ，CLH2 and PORA could be the main reason resulted in 18 leaf color mutants ，mutation of yellow-leaf- specific genes was also affected the variation of leaf color.* 通信作者 Author for correspondence （E-mail ：shensx@ ）2216 园艺学报41卷 Key words：Chinese cabbage；EMS mutation；leaf color；HRM；chlorophyll fluorescence叶色突变体作为研究植物叶绿素合成分解途径、遗传表达机理、光合作用机制的特殊材料，具有重要的研究意义。
高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术，可以辅助表型筛选，高效精细地鉴定点突变位点。
将HRM技术应用于芸薹属甲基磺酸乙酯（EMS）诱变育种中具有巨大的发展潜力。
该技术是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况（Gingerast et al.，2005；Hoffmann et al.，2007），利用高通量遗传变异扫描系统Lightscanner，高灵敏高特异性地扫描最长达400 bp的扩增子中是否存在变异。
目前在模式植物拟南芥中已经鉴定出了突变体ch1的相关基因（Block et al.，2002；Pontier et al.，2007）。
大白菜和拟南芥同属十字花科，存在大量同源基因，利用拟南芥相关基因鉴定大白菜叶色突变体，为大白菜叶色突变机理的研究提供了条件。
本试验利用经EMS 诱变获得的大白菜叶色突变体，对其在生殖期的叶片光合特性进行了研究，并通过HRM技术对相关基因的碱基变化进行了鉴定，旨在为创造可稳定遗传的叶色突变材料奠定基础，为叶色突变体的应用提供更多的理论依据。
1 材料与方法1.1材料选用经EMS诱变大白菜自交系A03的种子获得的叶色突变体（卢银等，2014）M2世代42株及野生型A03作为试验材料。
于2013年9月播种于温室，同年11月大株留种，2014年1月移栽，进入生殖生长时期，正常管理。
1.2方法1.2.1 叶绿素含量与叶绿素荧光参数的测定参照刘绚霞等（2004）的方法测定叶绿素含量。
采用德国WALZ公司生产的调制式荧光成像系统（MINI-IMAGING-PAM）测定叶绿素荧光参数（Genty et al.，1989；王俊玲等，2011）——PSⅡ最大光化学量子产量F v/F m、光化学荧光猝灭系数q P、非光化学荧光猝灭系数q N、实际光化学量子产量Y（Ⅱ）、调节性能量耗散的量子产量Y（NPQ）、非调节性能量耗散的量子产量Y（NO）、吸光系数Abs。
1.2.2 高分辨率熔解曲线（HRM）分析分别取叶色突变体及野生型新鲜叶片采用CTAB法提取DNA，利用微量分光光度计K5600测定DNA模板浓度，分别稀释至100 ng · µL-1。
叶色基因来源于大白菜基因组数据库（http：//），共发现大白菜6个黄叶特异基因（YLS2-1、YLS2-2、YLS9、YLS7、YLS4、YLS8）及5个叶绿素相关基因（ATRCCR、CLH2、HCF164、PORA、HCF107）。
应用软件Premier 5分别设计了14和12对引物（表1），扩增片段为50 ~ 400 bp。
PCR反应体系参考Xiao等（2013）的报道。
样品在避光96孔板中（野生型3次重复）进行PCR 扩增，PCR反应总体系10 µL，体系中各组分含量为：10 PCR Buffer（含Mg2+）1 µL，2.5 mmol· µL-1 dNTPs 0.8 µL，1 U Taqase 0.1 µL，50 ng· µL-1 Forward primer 0.5 µL，50 ng· µL-1 Reverse primer 0.5 µL，100 ng· µL-1模板DNA 1 µL，其它用灭菌双蒸水补齐。
PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，退火温度30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，保证扩增出单一条带。
11期刘梦洋等：大白菜叶色突变体的HRM鉴定及其叶绿素荧光参数分析 2217表1 叶色相关引物信息Table 1 The information of leaf-color-related primers白菜基因Brassica rapa gene 白菜注解Brassica rapa annotation拟南芥基因A. thalianagene引物名称Primername引物Primer（5′–3′）片段位置Fragmentlocation片段大小/bpFragmentsizeLY1 F：TCCACGGAGAAGTCATAGR：CGTTAGCGAAGTAAAGGTC368 ~ 722 355YLS2-1 黄叶特异基因2-1Yellow-leaf-specific gene 2-1AT3G51430LY2 F：TATTACATCAACGAGGAGCR：AAGAAAGGGTATCTAAACG869 ~ 1 097 229LY3 F：ATACCTCCACTCGCTCTT R：TCACGGATGCTTCTTACA 441 ~ 763 323YLS2-2 黄叶特异基因2-2Yellow-leaf-specific gene 2-2AT3G51430LY4 F：GAGATGCCATTAGCGAAGTR：GACGGATGAAGCAGAAGG616 ~ 837 222YLS9 黄叶特异基因9Yellow-leaf-specific gene 9 AT2G35980 LY5 F：TCTACGGTCCATCAGTCCR：TGAGCCAGAAGATAAGAGC29 ~ 184 156LY6 F：GACCATCTTGCGGACTTGR：TCGCTTGCTGCTCATACA1 180 ~ 1 325 146LY7 F；TAACACGCCTCCATTGCTR：GGTCTCCCATTGCCCTGA243 ~ 557 315 LY8 F：TTGCGTTTGCTATTGGTGR：TCTGCTGCTACTATGGTGA59 ~ 294 146YLS7 黄叶特异基因7Yellow-leaf-specific gene 7AT5G51640LY9 F：ATGATGTGCCTTCTTTGGR：GTTGGTCGAGCTTGAGTT700 ~ 950 251LY10 F：AGAAGCACTATCGAACCCTG R：CAGCCGTAAGTAACCATTTC 971 ~ 1 072 102YLS4 黄叶特异基因4Yellow-leaf-specific gene 4AT5G11520LY11 F：CCATGTTGGCTGAGGAATR：CACGGATCAAGGAGTATCTT1 215 ~ 1 607 393LY12 F：TTAGGAGCAATCACCAGCR：TATGAAGGACAAGCAGGA29 ~ 115 87LY13 F：AAACTCCTGCTTGTCCTT R：AGCGTCTCGTCGTCATAC 94 ~ 476 383YLS8 黄叶特异基因8Yellow-leaf-specific gene 8AT5G08290LY14 F：CAGCCCACGACCTTTCCTR：AGGTGCTTGCGTCTGTTG43 ~ 302 260CH1 F：AAAGACCTAGTTCGTCACCCTG R：ACGCTCCAACCAAACCTCAA 750 ~ 1 004 255ATRCCR 拟南芥红绿色素分解产物还原酶Arabidopsis thaliana redchlorophyll catabolite reductase AT4G37000CH2 F：GGGAAGACTTATGGATTGR：TAGATTTGGGTAAACTGG1 774 ~ 1 882 109CH3 F：CTTGCCTCTAATCCCTTCAR：GATACTCGTCCGACCTAA184 ~ 500 317CLH2 叶绿素酶2Chlorophyllase 2AT5G43860CH4 F：GTCCAAATGCCCGTAATCR：TTCCACCACAAGTAACACCA220 ~ 596 377CH5 F：CAAGTGCGTTGACATTCTR：CATTTATAGGGTTAGGGAG105 ~ 393 289CH6 F：TCGTAAGGCAAGGCTGAAR：GGAGAAATTGGTGGTGGA841 ~ 1 050 210CH7 F：CAGAAGCAACAGCGACTC R：GTGGATAATGGCTCAACT 929 ~ 1 037 109HCF164 高叶绿素荧光164High chlorophyll fluorescence 164AT4G37200CH8 F：GAGCCATTATCCACCACCR：GCCAGATTCTTCCGAGCC1 024 ~ 1 149 126CH9 F：CTTCTCGCTAACTTCCCAAACR：AGACCTCGGCTTCATTCG19 ~ 104 86CH10 F；ATACAACCAGGGTAGAGG R：CGATGATAGATGGAGGAG 378 ~ 519 142PORA 原叶绿素质化还原酶Protochlorophyllideoxidoreductase AAT5G54190CH11 F：AAAGTGCCCTAAATGGTTR：GTGAGGCAGTTCGTTGAT1 042 ~ 1 194 153HCF107 高叶绿素荧光107High chlorophyll fluorescence 107 AT3G17040 CH12 F：CCAAACGCTTGCCTTACTR：GATATGGTGGCCTGCTTA987 ~ 1 064 78PCR扩增产物在Lightscanner（Idaho Technology）仪器上进行HRM鉴定，与野生型比较熔解曲线，确认突变株（Lochlainn et al.，2011）：样品在70 ~ 96 ℃的温度条件下逐渐减链，减链速度为0.1 ℃ · s-1。