禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法
1 范围
本标准规定了禽腺病毒4型（FAdV-4）荧光定量PCR检测方法。

本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及肝脏组织中FAdV-4的检测。

2 规范性引用文件
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 试验原理
实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与DNA双链非特异性结合的SYBR Green I荧光染料。

当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。

随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

4 试剂或材料
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T 6682规定的一级水。

4.1 10×磷酸盐缓冲液PBS：pH值7.2。

4.2 研钵。

4.3 病毒DNA提取试剂盒。

4.4 SYBR Green I qPCR混合物。

4.5 阳性对照：浓度为1.0×105拷贝/μL的阳性质粒。

4.6 阴性对照：水。

4.7 DEPC水。

5 仪器设备
5.1 微量可调移液器：最大量程为10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。

5.2 台式低温高速离心机：最高转速16 000 r/min。

5.3 分析天平：精度为0.01 g。

5.4 荧光定量PCR仪：温度范围4.0 ℃～99.9 ℃。

5.5 冰箱：规格为4 ℃和-20 ℃。

5.6 二级生物安全柜。

6 引物
P1：5’- GTCTATACCAACACGAGCACC-3’
P2：5’-TTTTGTACCCGTCGCAGAG-3’
7 样品
7.1 采集工具
棉拭子，剪刀，镊子，1.5 mL离心管。

7.2 样品采集
7.2.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子
7.2.1.1 咽喉拭子采样：将棉拭子深入喉头来回刮3次，取咽喉分泌液，放于含抗生素（青霉素2 000 U/mL+链霉素2 mg/mL）的10×磷酸盐缓冲液PBS（pH值7.2）的1.5 mL离心管中。

7.2.1.2 泄殖腔拭子采样：将棉拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便（需有可见粪便），放于含抗生素（青霉素10 000 U/mL+链霉素10 mg/mL）的PBS中。

7.2.2 组织样品
待检禽无菌采集整个肝脏，装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。

7.3 样品运输与保存
样品放于保温箱中加冰，密封，24 h内送至实验室，如不能立即检测，需将样品放于-20 ℃冰箱保存。

7.4 样品处理
7.4.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子
将装有咽喉拭子/泄殖腔拭子的1.5 mL离心管在振荡器上充分混合后，取出棉拭子，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。

7.4.2 组织样品
将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（1：5～10）加入灭菌PBS进行充分研磨，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。

8 试验步骤
8.1 病毒DNA提取
用病毒DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待检样品的DNA。

病毒DNA提取成功后置于-20 ℃保存备用。

8.2 荧光定量PCR反应体系
详见表1。

表1 荧光定量PCR反应体系
每次均应设阴性对照。

* 内含DNA聚合酶，dNTP Mixture，Mg2+和荧光染料SYBR Green。

8.3 荧光定量PCR反应程序设定
详见表2。

表2 荧光定量PCR反应程序设定
9 结果判定
9.1 结果分析条件设定
阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。

9.2 试验成立条件
9.2.1 阴性对照无Ct（或Cp）值并且无扩增曲线。

（参见附录A.1）
9.2.2 阳性对照Ct（或Cp）值≤35，并出现特定扩增曲线。

（参见附录A.2）
9.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此试验视为无效。

9.3 结果描述及判定
9.3.1 阴性
无Ct（或Cp）值并且无扩增曲线，表明样品中无FAdV-4。

9.3.2 阳性。