2、细胞外冰晶损伤
慢速冷冻时，冰晶首先在细胞外形成。细胞外 液冰晶形成后，使得溶液中离子浓度的升高， 对细胞产生了离子影响，此损伤又称盐损伤。
随着更多冰晶的产生，使溶液逐渐浓缩，溶液 的浓缩对细胞的影响越来越大，此现象被称为 溶液效应又称为化学损伤。
冷却的速度越慢，则浓度越高，对卵母细胞的 作用时间也越长，对卵母细胞膜蛋白复合体造 成的伤害也越大。这主要是由于细胞内外的电 解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏 和核膜的降解。
单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二极体 的排出，新陈代谢逐步加强）母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存， 由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因而 冷冻保存的难度较大。
在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤， 主要包括在以下几个方面：
快速冷冻时，由于降温速率快，结晶时的冰晶 核较多，从而形成数目多且体积小的冰晶，对 细胞造成的损害较小。
如果解冻时采取快速复温，则细胞仍能存活 ，但若在解冻过程中，在温度较高的区域（ 如-40℃或更高）经历较长时间或进行慢速复 温，则会产生重结晶现象，即细胞内小冰晶 重结晶成大冰晶，从而机械性的破坏细胞的 超微结构而造成细胞的致命损伤。
目前，欧、美、日、加等国有上百家胚胎移植公 司从事牛羊胚胎移植业务。
在国内，牛的冷冻胚胎生产与移植已开始逐步商 业化。
第二节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存原理
胚胎与精子细胞结构差异： 胚胎数量极少 胚胎体积比精子大很多(精子为9um,卵子直径为
120um),细胞质多,外包特殊膜—透明带。 胚胎结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精子为
1998年，Vajita等首次采用OPS法冷冻牛卵母 细胞取得了成功，体外受精后囊胚发育率达 11％～25％。
2002年Amir等结合微滴法和超低温液氮的方 法，取得了20%的囊胚率并获得一头健康小 牛。
迄今为止，卵母细胞的冷冻保存以小鼠、牛 为主要研究对象，其冷冻方法趋于成熟，冷 冻后的卵母细胞形态正常率、受精率、发育 率及移植后的产仔率等方面均取得了一定进 展。
第一节 卵母细胞与胚胎冷冻保存的意义与发 展概况
一、卵母细胞冷冻保存的意义
(1)哺乳动物卵母细胞的有效冷冻保存是保护 品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障 之一。
(2)是加快家畜品种改良和胚胎移植技术产 业化的重要组成部分，可代替活畜进口，不受 时间和空间的限制。
(3)可用于卵母细胞的低温生物学特性和体外 受精机理研究。
牛卵母细胞冷冻的研究主要集中在玻璃化方 法的应用和寻求减少冷冻液体积和加快降温 速率的方法上，在低温生物学机理和探讨冷 冻损伤的机理方面做的还不够，因此，卵母 细胞的冷冻保存条件及低温生物学特性等方 面还有待进一步研究。
二、胚胎冷冻保存的意义与发展概况
（一）胚胎冷冻保存的意义
为建立优良的动物胚胎库和基因库提供了条件；
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。
1、细胞内冰晶损伤
胚胎与精子相比，含水量较高，而在冷冻过程 中，有90 ％的水分形成游离水，而游离水易形 成冰晶，从而破坏蛋白质的硫氢键，发生不可 逆变化，导致细胞死亡。
在胚胎及卵母细胞冷冻过程中，当温度降低到 冰点以下，在细胞外液内液都有冰晶产生，使 细胞受到致命性的损伤（物理损伤），这个因 素也是胚胎及卵母细胞冷冻保存的关键。
章动物卵母细胞与胚胎的冷 冻保存技术
目录
第一节 卵母细胞与胚胎冷冻保存的意义与 发展概况
第二节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存原理 第三节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存方法
卵母细胞与胚胎的冷冻保存：是采取
特殊的保护措施和降温程序，是卵母细 胞或胚胎在-196℃条件下停止代谢，使 细胞处于新陈代谢和分裂速度停止，即 使其发育基本处于暂时停顿状态，而升 温后又不失去代谢恢复能力的一种长期 保存胚胎和卵母细胞的技术。
3、破裂损伤
采用常规法冷冻的卵母细胞或胚胎解冻 后可见到透明带破裂，这主要是由于物 质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被 称作破裂损伤。
由此可见，破裂损伤往往发生在液相和 固相急速转化的过程中。
因此，慢速冷冻时缓慢通过冷冻液变相 温度区域非常重要。慢速解冻法通常是 以4～25℃/min的速率使胚胎由冷冻保存 温度逐渐升至室温。
胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊 （Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
在国内，绵羊、兔、牛、山羊等动物冻胚移植也 均获得成功。
可使因疾病、天灾或战争等其他原因丢失的各 种动物品种、品系和稀有突变体得以保持；
可以控制品种内的遗传稳定性和维持某些近郊 系动物的遗传一致性，节约大量时间和资金；
家畜胚胎库的建立可实现简便廉价的远距离运 输胚胎，以代替运输活畜，节约运输和检疫成 本；
减少因活畜运输而传播疾病的机会，促进了国
（二）胚胎冷冻保存的发展概况
(4)通过冷冻保存卵母细胞，不但可以建立雌性 动物的基因库，还可以充分利用丰富廉价的卵 母细胞资源，使体外受精、转基因及克隆等技 术的研究应用不受时间和地域的约束。
(5)在医学方面，人卵母细胞的冷冻保存可以克 服胚胎冷冻保存所引起的伦理道德以及法律上 的问题，为那些接受化疗、放疗或由于其它病 理原因而过早摘除卵巢或输卵管堵塞病人提供 怀孕的机会。
二、卵母细胞冷冻保存的发展概况
卵母细胞的冷冻保存开始于1976年。
1977年，Whittingham首次成功地冷冻保存了 小鼠的成熟卵母细胞，受精后获得了后代。
随后，Al-Hasan等对兔卵母细胞冷冻保存后 受精，移植后也得到了后代。
家畜的卵母细胞冷冻保存主要集中在牛上， Lim等首次成功冷冻保存了牛的卵母细胞，且 第一头超低温冷冻保存的卵母细胞产生的牛犊 出生于1992年。