山地农业生物学报25(6):554~557,2006Jour nal of M oun tai n Agricu lture and B iology⑥菌株产蛋白酶液体发酵条件优化枯草芽孢杆菌B1郭成栓,谢和(贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025)关键词:枯草芽孢杆菌;蛋白酶;液体发酵;影响因素中图分类号:TQ92016;TQ92512文献标识码:A文章编号:1008-0457(2006)06-0554-04Opti m iz i n g li q ui d fer m entation conditions of protease by Bacill u s subtilis B1⑥GUO Cheng-shuan,X IE H e(Co llege of L ife Science,Gu izhou University,Guizhou Guiyang550025,China)K ey word s:B acillus subtilis;protease;liquid fer m en tati on;a ffecti ng fac tors蛋白酶作为一种重要的酶制剂,广泛应用于医药、食品、酿造、纺织以及洗涤剂等行业[1-2],在工农业生产和人们的生活中发挥着重要的作用。
本实验室从酱香酒高温大曲中分离到1株产酱香兼性嗜热枯草芽孢杆菌B1⑥,该菌株可用来生产优异的具有浓郁酱香风味的食品[3]。
研究表明,该菌株产生的蛋白酶与食品酱香风味的产生具有密切的关系,利用提取的蛋白酶可发酵生产出酱香风味的食品[4],因而该菌株产生的蛋白酶在食品开发上具有重要的应用价值。
液体发酵一直是微生物生产酶类的主要方法,然而微生物的代谢过程受到p H、温度、溶解氧等一系列外界条件的影响,不同的菌株其发酵条件有非常大的差别,因此选择一个合适的发酵条件对于蛋白酶的生产是非常必要的。
为此,笔者测定了碳源、氮源、p H值、温度、接种量、种龄、溶氧量等条件对该菌株液体发酵产蛋白酶的影响,以确定其最佳发酵条件,以期为蛋白酶的液体发酵生产和应用奠定一定的基础。
1材料与方法111菌株兼性嗜热枯草芽孢杆菌B1⑥,分离自贵州珍酒高温大曲。
112培养基11211种子培养基细菌种子培养基:葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母膏5g、N a C1014g、KH2HPO40103g、CaC120102g、M gSO417H2O0102g,p H值710~712,121e、011MPa灭菌30m in。
11212发酵培养基碳源、氮源、NaC10.4g、KH2H PO40.03g、C a C120.02g、M gSO417H2O0.02g、p H值710~7.2,121e、011MPa灭菌30m i n。
113蛋白酶活力测定采用FoLin)酚法[5]。
2结果与分析211不同氮源对产酶的影响以2g葡萄糖作为碳源,大豆粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵各2g作为氮源,培养基装收稿日期:2006-06-02;修回日期:2006-07-03作者简介:郭成栓(1977-),男,河南南阳人,华南理工大学在读博士生,主要从事发酵工程的研究。
量为50mL ,自然p H 值,40e 、200r #m i n -1发酵48h ,测定酶活力。
不同氮源的酶活力分别为634L #mL -1、460L #mL -1、520L #m L -1、354L #mL -1、686L #mL -1、0L #mL -1。
由此可见,以牛肉膏为氮源产酶量最高,以硫酸铵作为氮源时则不产酶。
212 不同碳源对产酶的影响以筛选出来的2g 牛肉膏作为氮源,小麦粉、玉米粉、小麦粉+玉米粉、蔗糖、木糖、乳糖葡萄糖各2g 作为碳源,培养基装量为50mL,自然pH 值,40e 、200r #m i n -1发酵48h ,测定酶活力。
不同碳源的酶活力分别为505L #mL -1、461L #m L -1、576L #mL -1、668L #mL -1、518L #mL -1、508L #mL -1、708L #mL -1。
以葡萄糖作为氮源时,产酶量最高,这可能是因为葡萄糖结构简单,是最容易被利用的单糖,不需要被降解和转化。
213 发酵培养基优化实验以葡萄糖、大豆粉、N a C l 作为三因素,采用三水平(单因子初筛)正交实验:葡萄糖(3,4,5)、大豆粉(3,4,5)、NaC l(0.4,0.6,0.8),培养基装量为50mL ,自然pH 值,接种量体积分数为2%,40e 、200r #m in -1发酵48h,测定酶活力。
从表1和图1可以看出,葡萄糖为3g ,大豆粉为4g ,NaC1为016g 时的培养基,产生蛋白酶量最高,说明这是产蛋白酶最优培养基。
从表1还可以看出,各因子对蛋白酶产量影响大小为大豆粉>葡萄糖>N a C1,大豆粉在蛋白酶生产中的作用比较大,极差比较明显。
表1 培养基优化正交实验极差分析Tab 11 The ana lysis o f devia ti o n o f orthogona l expe rm i en t o f optm i izing med ium处理号1葡萄糖2大豆粉3NaC l A B C 重 复 实 验 结 果12总 和11(3)1(3)1(014)11121082219421(3)2(4)2(016)15121490300231(3)3(5)3(018)10421034207642(4)1(3)2(016)10101045220552(4)2(4)3(018)12561314257062(4)3(5)1(014)10361102213673(5)1(3)3(018)910932184283(5)2(4)1(014)11701208237893(5)3(5)2(016)96210341986K 1727260916078K 2676179507043K c 362066198640820239K c 1121210151118K c 2112713251173A 1B 2C 2K c 3103410331068R B >R A >R CR178310105图1 各因素不同水平的生物效应F i g .1 T he b i o log ic effect o f each fac t o r in d i verse level555第6期 郭成栓,等:枯草芽孢杆菌B 1⑥菌株产蛋白酶液体发酵条件优化214 接种量对产酶的影响发酵培养基装量为50mL ,接种量体积分数分别为1%、2%、3%、4%,40e 、200r #m in -1下发酵48h ,测定酶活力。
从图2可以看出,接种量为2%时,其酶活最高。
这说明接种量为1%时由于菌体细胞量少,产酶量也相应降低;接种量为3%、4%时,菌体细胞量太多,在菌体生长期已把营养物质消耗完,到产酶期营养物质浓度降低,不利于菌体产酶,所以蛋白酶产量下降。
215 pH 值对产酶的影响发酵培养基分别配置成初始p H 值为610、710、810、910、1010,装量为50mL,接种量体积分数为2%,40e 、200r #m i n -1发酵48h ,测定酶活力。
从图3可以看出,在初始p H 值为810时,灭菌后p H 值为710,即中性pH 值产酶量最高,这说明中性培养基有利于产酶。
216 温度对产酶的影响发酵培养基装量为50m L ,接种量体积分数为2%,200r #m i n -1分别置于30e 、40e 、50e 下发酵48h,测定酶活力。
从图4可以看出,温度为40e 时,其酶活最高。
217 种龄对产酶的影响发酵培养基装量为50mL ,接种量体积分数为2%,200r #m in -1分别接种种龄为16h 、24h 、32h 、40h 的菌种,40e 、200r #m i n -1下发酵48h ,测定酶活力。
从图5可以看出,接种24h 种龄的种子产酶量最高,这可能是24h 菌龄的菌株进入对数期,菌体产酶最高活性最强。
218 转速对产酶的影响发酵培养基瓶装量为50mL ,接种量体积分数为2%,分别在50r #m i n -1、100r #m in -1、150r #m in -1、200r #m in -1的振荡速度下培养48h ,测定酶活力。
从图6可以看出,随着摇床转速的增加,产酶量也随着增加,这说明增加溶氧量有利于产酶。
219 培养基装量对产酶的影响250mL 的三角瓶中分别装入25mL 、50mL 、75mL 、100mL 发酵培养基,接种量体积分数为2%,200r #m i n -1振荡速度培养48h ,测定酶活力。
从图7可以看出,随着培养基装量的增加,溶氧量降低,其产酶556山地农业生物学报2006年量相应减少。
对枯草芽孢杆菌B 1⑥菌株产蛋白酶液体发酵条件研究结果表明,其液体最适产酶条件:碳源为葡萄糖,浓度3%,氮源为大豆粉,浓度4%,pH 值810,温度40e ,接种量体积分数为2%,种龄24h ;同时随着溶氧量的增高,蛋白酶的产量随之增高。
但是枯草芽孢杆菌B 1⑥菌株发酵液黏性较大,可能是多糖产量较高,不利于蛋白酶的提取。
后续工作可以对菌株B 1⑥进行诱变育种,从而筛选产蛋白酶活力更高和蛋白酶更易提取的菌株。
参 考 文 献:[1]刘 传,董海洲,候汉学.淀粉酶和蛋白酶及其在焙烤食品中的作用[J].粮食与油脂,2002(6):38-391[2]SCHA LL M EY M ARCU S ,SI NGH A J AY,WARD OW EN P 1D eve l op m en ts i n the use of Bacill us spec ies for i ndustrial producti on[J].Canadian Journa l o fM icrobio l ogy ,2004,50(1):1-17.[3]吴龙英.产酱香芽孢杆菌在豆豉发酵上的应用[J].山地农业生物学报,2000,19(3):237-2381[4]邵元龙,谢 和.两株枯草芽孢杆菌蛋白酶的提取及产酱香研究[J].郑州轻工业学院学报:自然科学版,2005,20(3):51-531[5]陈毓荃.生物化学实验方法和技术[M ].北京:科学出版社,2005:183-1861557第6期 郭成栓,等:枯草芽孢杆菌B 1⑥菌株产蛋白酶液体发酵条件优化。