抗肿瘤药物的几种初筛模型
2003/6/27
于志斌
前言
近年来,国内外在海洋生物抗肿瘤活性物质筛选和研 究上已取得了初步的成果。NCI每年筛选的出3万个新 的抗肿瘤化合物这些化合物绝大多数具有独特的化学 结构和明显的抗癌、抗病毒作用, 有以影响ＤＮＡ、 ＲＮＡ、蛋白质为主的,也有以干扰有丝分裂或诱导细 胞内信息分子的改变为主的。除了一些新的化合物， 在一些老的化合物中也发现很多具有抗肿瘤的活性。 活性化合物的筛选关键问题之一在于选择有效的活性 筛选模型。 本文对ＭＴＴ法、ＤＤＲＴ法、稻瘟霉法以及镰刀菌 等几种筛选模型进行简单的介绍。
镰刀菌模型筛选步骤
将镰刀菌接种在土豆培养基上,28℃培养1～2周 后,加入无菌水刮下孢子,摇匀过滤;以土豆液体 培养基稀释成1×104/ｍＬ孢子的孢子液, 然后 将50μＬ待筛样品，分别加到96孔板,第1行各孔 中(从第3列开始,第1、2列作空白对照),每1列从 第1行开始依次稀释到最后一孔(即第8行),然后 在28℃培养16ｈ,在倒置显微镜下观察孢子及菌 丝体生长形态变化情况,根据上述活性指标,判 断活性,计算最小活性浓度。
DDRT法（different DNA repair test）
试验菌株 343/591为赖氨酸和生物素营养缺陷型并具 有发酵乳糖能力和DNA修复缺陷的菌种；343/636为不 能发酵乳糖的脯氨酸营养缺陷型菌株并具有紫外线损 伤和DNA修复能力。 DDRT法是一种利用两个菌株对DNA损伤修复的差异 性建立的方法,可以用来检测试验物的DNA毒性。 343/591为DNA修复缺陷菌株,而343/636菌株具有紫外 线损伤和DNA修复能力,因而通过两个菌株的修复能力 不同可以检测出受试物的DNA毒性。因而DDRT法可 用于筛选得到作用于DNA的抗肿瘤活性菌株。
稻瘟霉模型
近年来,人们发现大量的抗真菌和抗肿瘤化合物有明显的致 稻瘟霉菌丝弯曲作用或抑制发芽管生长作用,说明化合物使稻瘟霉 分生孢子或菌丝形态生长异常(卷曲、膨胀、菌丝分枝过多或念珠 状等)或生长抑制与其抗真菌、抗肿瘤活性之间存在一定的相关性。 因此,利用稻瘟霉这一模型筛选抗真菌、抗肿瘤活性菌株有一定的 实验依据。 稻瘟霉为一种植物病原真菌,中间有2个横隔为多细胞丝状真菌, 其个体比较大,形状特殊,呈亚梨形,易于观察;在沙氏培养液中进行 培养只需14～16ｈ,因此非常快速;用96孔平板进行定量,操作程序 简单、易于掌握;菌种引进后由自己传代培养,比较经济;此外,用样 量少,重现性好,决定其作为初筛模型的优越性。
稻瘟霉活性筛选指标
抑制孢子芽萌发,孢子基本保持原有状态为抑制活性,用“×”表示 （a）;孢子不萌发、萌发或菌丝生长,但形态发生严重变化,为强变 形活性,用“+++”表示(b);孢子萌发或菌丝生长,但形态发生中等强 度的变化,为中等变形活性,用“++”表示(c)。菌丝生长,但生长状态 异常,为弱变形活性,用“+”表示(d);菌丝正常生长为阴性,用“-”表 示(e)。
MTT法
ＭＴＴ法是一种检测细胞生存和增殖状态 的方法,该方法以其简单、快速、准确等优点被 用于细胞毒和淋巴因子生长抑制的定量检测,尤 其在肿瘤化疗药敏实验中广泛使用。其原理是 ＭＴＴ可被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为蓝 色的甲基化合物,再经适当溶剂溶解后,其吸光 度与活细胞数相关,从而可作为检测活细胞数的 指标。因此ＭＴＴ法可用于细胞毒活性物质的 筛选。
小结
这几种抗肿瘤筛选模型，具有相同的优点： 灵敏度高、重现性好、用量少、费用低、操作 简便、快速、安全等特点,是很好的初筛模型, 可广泛用于抗肿瘤活性物质的筛选。例如稻瘟 霉筛选模型和镰刀菌筛选模型，几乎相同的仪 器设备，而且操作简单，一般实验室即可实现； 与价格昂贵的流式细胞仪相比费用要低很多。 微生物的次级代谢产物是生物活性物质的 重要来源，开展新药的研究与开发，就必须加 强其生物活性物质的筛选。
镰刀菌筛选模型
中国热带农业科学院热带作物生物技 术国家重点实验室在筛选抗镰刀菌抗生 素时发现镰刀菌也可应用于抗肿瘤、抗 真菌活性物质的筛选,为此他们建立了镰 刀菌筛选模型, 应用于海洋微生物抗肿瘤 活性物质的筛选。 镰刀菌活性筛选指标与稻瘟霉指标相同。
植物类药物HH、VCR、HCPT可能是通过与细胞微管蛋白结合使其不 能形成纺锤体,促进微管解聚而抑制细胞周期中Ｍ期的有丝分裂。抗 代谢药物5－ FU可能是通过阻碍Ｓ期的ＤＮＡ合成,从而抑制孢子萌 发或使菌丝变形。烷化剂CTX、金属络合物DDP以及抗生素类药物 MMC则可能是通过直接破坏增殖期或Ｇo期的细胞DNA,从而影响菌 丝的生长。结果表明,上述7种抗癌药在一定程度上均影响镰刀菌分生 孢子或菌丝生长，因此镰刀菌筛选模型可用于抗肿瘤活性物质筛选。
MTT法的基本步骤
细胞培养至90%铺底(处于对数生长期),用胰酶消化液消化收集细 胞,吹打制成单细胞悬液,苔芬蓝染色计算活细胞数,接种细胞于96 孔板中,每孔加200µ l悬浮细胞液,在37℃ CO2培养箱培养过夜。第 二天加入各稀释度的菌株发酵液20 µ l,继续培养3ｄ,倒去培养 液,PBS洗1遍,加入ＭＴＴ(0.2ｍｇ/ｍl)100 µ l,在37℃培养4ｈ,然后 去除ＭＴＴ,加ＤＭＳＯ与甘氨酸ＮａＯＨ缓冲液(9∶1)200 µ l,摇 床摇0.5～1ｈ,酶标仪测定570nm吸光值。其中四孔做全培液空白 对照,四孔做细胞悬浮液对照,每样平行测试3孔,以阿霉素为标准参 照.。计算抑制率： 抑制率=100%×(ＯＤ对照-ＯＤ实验)/ＯＤ对照 发酵液活性以ID50衡量,ID50为抑制率为50%时,发酵液所稀释 的倍数；抗癌药物的活性以IC50衡量,IC50为抑制率为50%时,样品 的浓度。
稻瘟霉筛选模型的步骤
将稻瘟霉接种在土豆培养基上,在27℃下培养12ｄ左 右,收集分生孢子,混悬在10ｍＬ无菌水中,过滤除去菌丝 体得孢子悬液,孢子悬液中加入300μＬ沙氏液体培养基 后,以每孔50μＬ的量加入到96孔培养板的各孔中。将 各菌株的发酵液分别过滤除去菌丝体,取50μＬ滤液分 别加到96孔板的第1行各孔中(从第3列开始,第1、2列作 空白对照),每1列从第1行开始依次稀释到最后一孔(即 第8行),然后27℃培养16ｈ,在倒置显微镜下观察孢子及 菌丝体生长形态变化情况,根据上述活性指标,判断活性, 计算最小活性浓度。
DDRT法的步骤
343/636和343/591菌株分别接种于含5ml蛋白胨-肉汤培 养基中； 在37℃振荡培养16ｈ； 用分光光度计测 450ｎｍ处的343/591和343/636的ＯＤ值,用蛋白胨-肉汤 培养基稀释343/636菌液使其ＯＤ值与343/591相同； 在100ml中性红琼脂培养基中加入1ml菌液后倒入平皿 中静置1ｈ； 将所要测定的放线菌发酵液和受试物滴 加在覆盖于琼脂培养基上直径为8ｍｍ的滤纸片上；37℃培养24ｈ,以丝裂霉素为标准药物对照,根据发酵液 产生的抑菌圈大小的差异来判定其对ＤＮＡ造成损伤 的大小及是否有抗肿瘤活性.