蛋白酶活性的测定方法及原理
各种测定方法及原理
考马斯亮蓝法 甲醛滴定法
DHT-酪蛋白法 DNA-溴乙锭荧光分析法
X-光胶片法 福林酚法
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
• 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合， 主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是 精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料 的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶 液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测 定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
• 蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固 定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定 生成的氨基酸，从而测定其酶活。
D考H马T-斯酪亮蛋蓝白法法
• 用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和 酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪 蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物， 在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离 子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性 红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋 白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离 子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法 可测定蛋白酶酶活。
考马福斯林亮酚蓝法法
• 福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还 原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中 有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使 蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理 测定蛋白酶酶活。
重 本次实验就是采用福林酚 点 法测定蛋原理 • 蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。 磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不 稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合 物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋 白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接 测定蛋白酶的活力。
仪器
• 分析天平：精度0.0001g • 恒温水浴：精度±0.2℃ • 计时表 • 分光光度计 • 沸水浴器 • 振荡混合器 • pH计: 精度0.01pH单位
试剂
• 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 • 磷酸缓冲液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 • 硼酸缓冲液 (pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶 • 0.4mol/L碳酸钠溶液 • 0.4mol/L的三氯醋酸液 • 0.5mol/L的NaOH • 10.00mg/ml酪素溶液 • 100μg/ml酪氨酸标准溶液
标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液按下表配制
分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使 用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不 含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为 横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常 数K值，其K值应在95~100范围内。
考X马-光斯胶亮片蓝法法
• 酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液 滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶 水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被 酶水解的地方，出现透明的圆圈。酶活性的高 低与透明圆圈的面积成正比。测定圆圈的面积 以测定蛋白酶的活性。。
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影响酶活力的因素有哪些？ ①酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，在一定范围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。 ②底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，酶促反应速度与底物浓度呈正比，即随底物浓度的增加而增加。当
③温所度有对的酶酶活与力底的物影结响合：生在成适中宜间的产温物度后范，围即内使，再酶增促加反底应物速浓度度随，温中度间T升产it高物le而浓增度加也，不超会过增最加适，反酶应促温反度应，速酶度活也力不将会会增下加降。。
计算 蛋白酶的活力= A×K×T4/it1l0e×n U/g(ml)
A：样品平行试验的平均OD值 K：吸光常数 4：反应试剂的总体积 1 0：酶解反应时间 n：酶液稀释总倍数
思考题
蛋白酶有哪几类？ ①按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨 基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C水解蛋白质或多肽的酯键；D水解蛋白质或多肽的酰胺键。 ②按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶 ③微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶 ④按蛋白酶作用的最适PH可以分为（A）PH2.5~5.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.5~10.5的碱性蛋白酶，（C）PH7~8的中性蛋白酶
DNA-考溴马乙斯锭亮荧蓝光法分析法
• 溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使 DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭 (0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与 DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴乙锭溶 液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链 上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴 乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白 酶活性呈正比。通过测定DNA溶液的荧光增量 来计算蛋白酶的活性。
实验步骤
①
先将酪素溶液 放入 40±0.2℃恒 温水浴中，预 热5min
②
取4支试管， 各加入1ml酶 液
③
取一支作为空 白管，加2ml 三氯乙酸，其 他3管作为测 试管各加入 1ml酪素，摇 匀，40℃保温 10min
④
取出试管，3 支测试管中各 加入2ml三氯 乙酸，空白管 中加1ml酪素 。
⑤
静置10min， 过滤沉淀
⑥
各取1ml滤液， 加入0.4mol/L 的碳酸钠5ml、 福林试剂1ml。 在40℃显色 20min 680nm 处测OD值。以 空白管调零点 。
蛋白酶活性的计算
1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃（酸性pH=3.0、
定义 中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1min水解酪素产 生1μg酪氨酸为一个K酶：活吸力光单常位数。