项目名称：非整合人诱导性多能干细胞（iPS）及相关技术用于β地中海贫血治疗的研究首席科学家：潘光锦中国科学院广州生物医药与健康研究院起止年限：2012.1至2016.8依托部门：中国科学院一、关键科学问题及研究内容1、安全高效，具有临床实用性的非整合iPS新技术的优化及建立。

安全高效获得非病毒非整合iPSC的新技术建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC：利用mRNA及microRNA诱导体细胞获得iPSC，筛选能够加速iPSC重编程的小分子化合物及蛋白；筛选高效的iPSC诱导培养液。

在此基础上，建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC。

iPSC的鉴定：核型、基因表达、体外分化能力、体内多能性检测等多方面检测iPSC是否符合干细胞的标准；分子水平检测外源基因的插入；测序分析iPSC 的基因组稳定性。

建立非病毒非整合小鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC）筛选能够稳定培养ESC-like-iPSC的培养环境：通过传统的病毒诱导获得小鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC）；筛选小分子化合物稳定培养ESC-like-iPSC；筛选mRNA及microRNA支持ESC-like-iPSC的自我更新；建立非病毒非整合ESC-like-iPSC：开发诱导获得ESC-like-iPSC的诱导系统；在全基因组表达、小RNA表达等方面比较两种不同的iPSC的差异。

2、利用体外受精胚胎建立多株正常人及地贫病人的ES细胞系。

对比地贫iPS及ES，评价iPS多能性，安全性等应用指标。

建立非整合β地中海贫血病人iPS细胞库，约含各突变类型β地中海贫血iPS 细胞株50～100株。

优化和完善建立人胚胎干细胞的技术体系，并在此基础上建立地贫胚胎干细胞库。

本研究拟对现有的胚胎干细胞培养技术进行改进：利用不同发育阶段的IVF废弃的胚胎（从桑椹胚到孵出的晚期囊胚）分离的人ESC细胞进行均一性研究，寻找最优化的细胞分离时间；通过对人源性的饲养层细胞及无饲养层培养体系进行优化，建立安全、稳定的人胚胎干细胞系技术平台。

并在此基础上，建立不同突变类型β地中海贫血人胚胎干细胞株10株以上。

非整合β地中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞比较性研究。

对比研究地贫ES及iPS，建立其表观遗传和基因表达的数据库。

利用基因芯片及高通量DNA测序技术，对比检测地贫iPS与ES在SNP，DNA 甲基化(DNA methylation)，组蛋白修饰(Histone Modification)，外显子序列(Exon Sequencing)等方面的差异。

全面评价iPS在全能性，表观遗传学，基因组完整性，相关功能性细胞分化的能力等，明确造血分化用iPS的全能性，安全性等应用标准。

3、研究修复地贫iPS的突变基因。

探讨和评价经基因修复等操作后iPS的基因组及表观遗传的稳定性，多能性及安全性等指标。

建立多样性的非整合地贫iPS细胞库。

利用基因重组技术修复突变基因。

基因修复后iPS基因组及表观遗传学稳定性的研究。

通过基因芯片的技术手段检测基因修复后iPS的SNP，CNV等代表基因组稳定性的指标。

并进行外显子测序(Exon Sequencing)来确定有无重要基因发生突变等。

利用CHIP结合高通量测序技术确定经体外基因修复后的iPS在组蛋白修饰，DNA甲基化等表观遗传方面的稳定性。

基因修复后iPS多能性的维持。

研究经体外基因操作后，iPS维持其多向分化潜能的能力。

通过非定向的分化手段如裸鼠体内畸胎瘤的形成，体外类胚胎（EB）的形成等手段对比基因修复前后地贫iPS的分化潜能。

并通过定向分化的方式如，神经分化，血液分化等对比探讨iPS在基因修复过程中的多能性维持。

4、iPS功能性血液分化的研究及基于动物模型的功能评价。

利用与不同人造血组织来源的的基质细胞，包括间充质干细胞共培养系统，优化建立iPS的功能性血液分化及造血干、祖细胞体外扩增实用性技术。

建立基于动物模型的造血干细胞分化，移植及安全性多功能的评价技术和指标。

采用不同造血组织来源人间充质细胞与人胚胎干细胞及iPS细胞共培养诱导造血分化，与目前较常用的EB形成及小鼠或其它组织来源的基质细胞共培养体系进行诱导效率的比较，筛选有效提高造血干细胞诱导效率的iPS细胞分化培养条件。

利用体外细胞长周期培养、单细胞培养分化实验以及体内NOD/SCID鼠造血重建实验、骨髓竞争移植实验等，与脐带血HSC细胞比较，评价多种来源的iPS 分化来源的HSC/HPC体内定向归巢、造血重建等生物学功能。

比较iPS细胞来源的造血干细胞与脐血造血干祖细胞向造血各系细胞分化，尤其是红系分化能力，并对相应的调控机制进行探讨，侧重研究Wnt3a、PGE2等分子的调控作用。

通过全基因组表达及表观遗传学分析，比较地中海贫血iPS细胞来源的造血干细胞与几种体内分离的造血干祖细胞，尤其是脐带血造血干祖细胞在编码及非编码RNA基因表达，DNA甲基化及组蛋白乙酰化等方面的差异，并用实时定量PCR加以验证。

根据实验得到的结果，选择20－30个目的基因进行干预，研究候选基因对造血干细胞细胞增殖，多能性和分化潜能等功能的影响。

比较不同来源的间充质干细胞（MSC）作为滋养层细胞并辅以不同细胞因子的混合培养体系对iPS诱导获得的HSC/HPC细胞体外扩增的作用，建立可以保持HSC/HPC细胞多能性功能并显著提高干细胞数量的培养条件，以满足临床移植应用的要求。

二、预期目标总体目标：由于遗传导致的β-地中海贫血是严重危害广东等地区的地方性疾病，目前尚无根治手段。

本项目的总体目标是探讨利用病人来源的无DNA整合污染的iPS，通过基因修复联合血液分化的技术途径，探讨建立一套从β-地中海贫血患者的iPS诱导到突变基因原位修复，再到修复后造血干细胞分化的完整技术，为β-地中海贫血患者的移植治疗提供大量自体来源的造血干细胞奠定基础。

同时也明确iPS实际应用的可行性及安全性等指标，本项目的完成不仅能够明确iPS及相关技术用于β-地中海贫血治疗的可行性，也为其他一些遗传病的治疗起到重要的借鉴作用。

五年预期目标：1、建立包含有不同突变类型的地贫病人特异性的无外源DNA整合的iPS库及ES细胞库。

约含各突变类型β地中海贫血iPS细胞株50～100株。

同时利用废弃的体外受精的胚胎建立10～20株地贫病人的ES细胞株及5株正常人的ES细胞株用于对比研究。

2、建立非整合β地中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞的基因组稳定性，表观遗传和基因表达的数据库。

明确iPS在组蛋白修饰，DNA甲基化等表观遗传方面的稳定性。

3、建立实用性的地贫突变基因修复的技术平台。

明确经基因修复后的iPS在基因组，表观遗传等方面的稳定性及干性维持等特性。

4、建立高效诱导iPS细胞分化为造血干细胞的培养条件及对分化的造血干细胞造血重建及移植功能的鉴定动物模型和相关技术；5、优化造血干细胞体外扩增的培养体系，筛选和鉴定可以用于对干细胞功能和安全性进行评价的分子标记物和指标；6、通过对比研究iPS诱导分化和脐带血来源的造血干细胞在基因表达及表观遗传特征上的差异，揭示针对造血干细胞增殖，分化及自我更新等生物学特性的新的调控机制。

7、优化非整合病人特异性iPS技术，将目前诱导效率提高100倍左右，诱导时间缩短到2周左右。

建立非整合小鼠ESC样的人iPS细胞技术。

明确新型人iPS 细胞的多能性，基因组稳定性，安全性等指标。

8、培养研究生30名，建立一支具有国际竞争力的，由优秀中青年科学家组成的创新团队，培养一批能独立从事高水平科学研究的后备力量；9、在本领域的国际代表性学术SCI刊物上发表20余篇学术论文，其中影响因子高于5的不少于10篇，培养博士生15名，博士后5名。

10、举办一次相关的国际性学术研讨会。

三、研究方案技术路线：研究方案：1、探讨优化建立快速高效的获得iPS的技术1）在mRNA诱导iPSC的基础上，通过筛选小分子化合物及蛋白，加速非病毒非整合iPSC的诱导；这一套系统我们已经在进行尝试。

接下来筛选促进重编程的microRNA，建立传统的iPSC（EpiSC-Lik-iPSC）。

2）利用Dox-inducible的载体（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）诱导体细胞获得ESC-Lik-iPSC；筛选能够维持自我更新的小分子，我们已经开始相关实验；在此基础上，尝试建立非病毒非整合的ESC-Lik-iPSC。

可行性分析该部分研究内容的主要承担者赵小阳博士所在的实验室在以往的研究中，开展了大量的诱导iPSC的研究工作，利用病毒为载体高效诱导获得iPSC；并对iPSC在分子水平上进行了充分的鉴定，以及完备的多能性检测。

本实验需要开展的工作中，mRNA的体外合成与纯化、microRNA的筛选工作我们已经开展，进展良好。

在我们之前的研究中，成功筛选出小分子化合物并改进了iPSC的诱导环境。

对于本课题的各个环节，我们进行了细致的研究探讨，认为我们基本掌握相关技术，因此，我们有信心成功完成预期目标。

创新性分析目前，国内外有多个实验室开展新的不依赖多能性因子的纯药物诱导方式，试图提高iPSC的诱导效率；本课题的特色在于，从提高iPSC的诱导速度出发，筛选新的小分子化合物及蛋白等各种因子，建立一个快速高效且简单易于操作的iPSC诱导系统，降低iPSC表观遗传突变及基因组不稳定的风险，力争应用于将来的临床实验中；新型的iPSC不仅在理论上有大的突破，还将为iPSC未来的临床应用提供基础，这种iPSC将在大规模培养、基因修复、分化上拥有巨大的优势。

与国内外其他实验室相比，本研究更注重与实际应用联系起来，以推动iPSC最终应用于临床治疗。

2、建立非整合β-地中海贫血的病人特异性iPS库。

本部分内容拟在该部分研究内容的主要承担者潘光锦博士以前的实验室建立起来的episome的方法的基础上进行一定程度的修改用来获得地贫病人的iPS。

该技术将诱导因子克隆到含有EB病毒来源的复制元件的质粒上，该质粒主要含有两种特殊元件，一是质粒复制子-oriP, 另一是复制蛋白-EBNA .通常情况下，普通质粒在进入细胞后如果不能整合到细胞的基因组中便不能进行自我复制，很快就会被细胞内的酶降解。

但是该系统的特点是当质粒导入细胞内后能够表达复制蛋白EBNA，表达后的EBNA随后结合在复制子oriP 上，使该质粒在染色体外不经过整合就可进行复制。

这样就保证了由该系统携带的诱导蛋白在整个iPS细胞诱导过程中得到表达。

在获得iPS细胞后，导入的episome质粒由于不进入整合到基因组，经过一定时间的体外培养便可逐渐失。

最终通过筛选便可得到完全无外源DNA整合的地贫病人的iPS细胞。