2 结果与讨论
211 菌种筛选
经太空飞 行 的 菌 种 经 富 集 , 用 平 板 分 离 , 挑 出 600株菌进行试管液体发酵 ,从中选出 27 个发酵水 平最高的菌株进行摇瓶发酵 ,其中卫 10、卫 32、卫 56 和卫 69四个菌株 L -乳酸产量分别达到 71125 ±0154、 70118 ±0168、70196 ±0156、72100 ±0134g /L , 出发菌株 L t的 L -乳酸产量为 62189 ±0152g /L。
代 ,每 24h转接一代 ,每隔两代摇瓶发酵测试 L -乳酸 发酵水平 。
11216 pH 的测定 用酸度计测定 pH。 11217 生物量的测定 用比浊法 (OD660 ) 。 11218 还原糖测定 采用 3, 5-二硝基水杨酸比色法 测定还原糖含量 [11 ] 。
11219 L -乳酸含量测定 L -乳酸含量采用电流型流 动注射式 L - 乳酸生物传感器测定 。电极酶膜为 L 乳酸氧化酶 , 载液为 011moL /L、pH710 的 N aH2 PO4 N a2 HPO4 缓冲液 - 5mmo l /L ED TA - 0102 %叠氮钠 。用 L -乳酸锂作标准 。 112110 发 酵 液 有 机 酸 组 分 分 析 发 酵 液 经 离 心 ( 10000 r /m in, 30m in, 4℃) 后 用 20mmo l /L H3 PO4 稀 释 ,用 H PLC分析 。有机酸色谱条件 :室温分离 ,流动 相 20mmo l /L H3 PO4 ,流速 1mL /m in, 210nm 检测 。用 L -乳酸锂作标准 。
食品工业科技 S cience and Technology of Food Industry
研究与探讨
利用木糖生产 L - 乳酸高产菌太空诱变育种
侯艳梅 1 ,江均平 2, 3 ,蒋立文 1 (11湖南农业大学食品科学技术学院 ,湖南长沙 410128; 21中国农业科学院农产品加工研究所 ,北京 100094)
试管旋转摇床 装 100 只试管 , 3～15 r /m in, 自 制 ; D Z- 032R 全温摇床 上海堪鑫仪器公司产 ; 5L 自 动 发 酵 罐 上 海 宝 生 公 司 产 ; HPLC 为 W a ters600E,用于有机酸分析的 HPLC 柱 CO SMO S IL 5C18- PAQ 为日本 NACALA I TESQU E, Inc 产 ; 电流 型流动注射式生物传感器 自制 。
212 遗传稳定性实验结果
我们对上述筛选到的 4 个菌株进行了遗传稳定 性测试 ,结果见表 1。菌株卫 10 传代 14 次 L - 乳酸 产量基本保持不变 ,而卫 32、卫 56、卫 69随传代次数 的增多 L -乳酸产量逐渐下降 ,故我们选出卫 10菌株 进行发酵罐发酵 。213 发酵罐发酵1 材与方法111 材料与设备
菌种 利用木糖产 L - 乳酸菌种 L t为嗜中温细 菌 ,由中国农业科学院农产品加工所食品微生物与 发酵工程实验室从土壤中分离而得 ; D -木糖 纯度 均为 98%以上 ; 蛋白胨 、牛肉膏 、酵母浸粉 为生物 试剂 ,北京化学试剂公司提供 ; L -乳酸锂 ( 97% ) 、L 乳酸氧化酶 ( 20U /m g) 为 Sigm a 产品 ; 其它试剂 均为分析纯 。
B reeding of bacteria p roducing L - lactic aci d using xylose by aerospace mutagenesis
HO U Yan - m e i1 , J IANG Jun - p ing2, 3 , J IANG L i - wen1
( 11College of Food Science and Technology, Hunan A gricultural University, Changsha 410128, China; 21Institute of A gro- Food Science and Technology, Chinese A cademy of A gricultural Sciences, Beijing 100094, China)
1121413 试 管 发 酵 取 一 接 种 环 斜 面 菌 种 接 入 含
将筛选到的卫 10菌株和出发菌株 L t进行 5L 罐
10mL 种子培养基的试管中 ,棉塞封口 , 52℃旋转培 养 16h;取 2mL 菌种接入含 10mL 发酵培养基的试管 ( 10 ×150mm )中 ,加入适量碳酸钙并补满发酵培养 基 ,用二层塑料膜封口 , 52℃旋转发酵 48h。 1121414 三角瓶发酵 150mL 发酵培养基 (250mL 三角 瓶 )接 15mL 菌种 ,用二层塑料膜封口 , 52℃、160r/m in 发酵 48h。每个菌株设三个重复。
摘 要 :利用太空诱变育种技术对利用木糖产 L -乳酸的野生菌株进行了诱变 ,通过富集 、平板筛选 、液体发酵筛选 、遗 传稳定性实验 ,最终得到一株正向突变菌株 L t- s。该菌株在 5L发酵罐水平上 ,以 8%的木糖为底物 ,于 52℃发酵 48h, L -乳酸产量达到 7010g/L ,糖酸转化率为 8710% , L -乳酸产量较出发菌株提高约 1210%。该菌株的获得为利用木质纤 维素生产 L -乳酸奠定了一定基础 。 关键词 : L -乳酸 ,木糖 ,纤维素 ,航天诱变育种
A b s tra c t: A p os itive b a c te ria s tra in L t- s p rod uc ing L - la c tic a c id us ing xy los e w a s ob ta ine d th roug h a e rosp a c e m u ta g e ne s is b re e d ing m e thod s 1 A fte r fe rm e n ta tion fo r 48h a t 52℃ w ith a 5L b io re a c to r, L t- s p rod uc e d 7010g of L la c tic a c id /L from 8% of xy los e, a b ou t 1210% h ig he r tha n tha t p rod uc e d b y the w ild s tra in1 Ke y wo rd s: L - la c tic a c id; xy los e; c e llu los e; a e rosp a c e m u ta g e ne s is b re e d ing 中图分类号 : TS20113 文献标识码 : A 文 章 编 号 : 1002- 0306 (2008) 02- 0074- 03
酵筛选 →遗传稳定性测试 →诱变菌株
11215 菌种遗传稳定性实验 [10 ] 菌株用琼脂斜面传
11212 培养基 1121211 富集培养基 蛋白胨 510g,牛肉膏 210g,酵 母膏 310g, K2 HPO4 210g,木糖 8010g,乳酸钙 2510g,蒸 馏水 1L , pH 715, 110℃灭菌 20m in。 1121212 分离培养基 蛋白胨 510g,牛肉膏 210g,酵 母膏 310g, K2 HPO4 210g,木糖 8010g,乳酸钙 3010g,蒸 馏水 1L , pH 715, 110℃灭菌 20m in;无菌 CaCO3 1%。 1121213 斜面培养基 蛋白胨 510g,酵母浸粉 210g, 牛肉膏 110g, N aC l 310g, K2 H PO4 210g,木糖 3010g,琼脂 1210g,蒸馏水 1000mL , pH615, 115℃灭菌 20m in。 1121214 种子培养基 蛋白胨 510g,牛肉膏 210g,酵 母浸粉 310g, K2 HPO4 210g,木糖 6010g,蒸馏水 1L , pH 自然 , 115℃灭菌 20m in。 1121215 发酵培养基 蛋白胨 510g,牛肉膏 210g,酵 母浸粉 310g, K2 HPO4 210g,木糖 8010g,蒸馏水 1L , pH 自然 , 115℃灭菌 20m in;无菌 CaCO3 7210g。 11213 菌种实验卫星搭载 取 015mL 7%脱脂乳 + 3%海藻糖于 2mL 冷冻管中 , 110℃灭菌 20m in,冷却 后接入 2接种环斜面菌种 ( 50℃培养 , 24h 种龄 ) ,混 匀 , - 18℃预冻一晚 ,真空冻干 。以此冻干管搭载我 国实践八号育种卫星 ,该卫星于 2006 年 9 月 9 日起 飞 , 9月 24日返回地面 。 11214 菌种筛选 1121411 菌种富集 用 2mL 生理盐水溶解卫星搭载 冻干菌种 ,取 1mL 菌种接入 10mL 富集培养基中 ( 15 ×150 试管 ) , 二层塑料膜封 口 , 52℃旋转 培养 5d。 重复富集 3次 。 1121412 平板分离 富集培养液用生理盐水稀释 ,用 分离培养基倒平板 , 52℃培养 3～7d。挑选最早长出 、 透明圈 /菌落直径比值大的菌落接入斜面 , 52℃培养 24～48 h。
收稿日期 : 2007- 08- 17 3 通讯联系人 作者简介 :侯艳梅 (1981- ) ,女 ,硕士研究生 ,研究方向 : 农产品加工及
贮藏 。 基金项目 :国家航天育种工程项目 (2006HT200) 。
74 2008年第 02期
48 h, 糖 酸 转 化 率 不 超 过 60% [7 ] 。 L actococcus lactis IO - 1利用木糖的浓度不超过 50g /L ,乳酸转化率为 53 % [8 ] 。上述研究表明 ,利用木糖发酵生产乳酸存 在发酵水平低 、糖耐受浓度低 、转化率不高 、发酵速 度慢等问题 。我们实验室对利用木糖发酵生产 L -乳 酸已研究多年 ,目前已筛选出一株比较高产的野生 菌株 。据报导 ,太空诱变育种具有变异频率高 、有效 变异多 、变异幅度大等特点 [9 ] ,因此 ,本实验室将该菌 株搭载实践八号育种卫星 ,以期利用航空诱变育种 进一步提高其生产性能 。