4. 嵌合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键
5. 通过非肽键形成嵌合蛋白质
第一节 蛋白质修饰的化学途径
虽然基因重组表达技术的应用对蛋白质结构功能的研究以 及蛋白质分子的改造提供了一条非常有效的途径，然而用化 学方法直接对蛋白质分子进行修饰有时仍然是很有用的方法 ，可以弥补正常生物表达体系的不足。例如，利用化学法和 酶法相结合，可以从猪胰岛素制备人胰岛素；通过区段特异 性取代制备适合于肿瘤定位的抗体；对用重组方法得到的多 肽进行C末端酰化以及制备各种类型的蛋白质嵌合体等。因 此化学法和重组方法的相互补充，使蛋白质工程的实施更有 效。 蛋白质工程的化学方法通常是产生半合成的结构，在此结 构中一个天然的多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔 合。产生这种缔合的方法主要有4种：①非共价缔合、②产 生二硫键、③形成肽键以及④产生非天然型的共价键连接。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
■ 一、功能基团的特异性修饰
★1. 多位点取代 ※(1)常规的氨基保护
氨 基 可 用 取 代 基 进 行 修 饰 。 常 用 的 取 代 基 有 两 种 ： tbutyloxy-carbonyl (Boc) 是 典 型 的 酸 不 稳 定 取 代 基 ， 而 Methanesulphonyl ethyloxy carbonyl (Msc)是典型的碱不稳 定取代基。这两种基团常用于对氨基进行临时保护，以防 止其他反应试剂对氨基的作用。当其他反应完成后，可分 别用无水三氟乙酸和强碱将Boc和Msc基团去除，很多多肽 或小分子蛋白质在这些基团去除后仍保持其活性。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
★ 2. 单一的或限制性取代
按照同样的机制，上面这个水解反应可以逆向进行，这样在 蛋白水解酶的存在下肽键可以重新形成，即一个肽的氨基（ 或其他非肽的亲核物）攻击酰化-酶中间体，从而导致肽键的 形成。这一逆反应（肽连接）的成立无论在科学理论上还是 在实际应用上都具有重要的意义。因为在常规肽合成中对氨 基酸侧链进行保护的操作可以省去，以这种可逆方式进行的 酶连接反应至少可以达到每年100kg的生产规模。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
★ 2. 单一的或限制性取代
用化学方法对蛋白质分子上单一的特定功能基团（如α-氨基） 进行修饰而不对与其相类似的基团（如ε-氨基）产生作用是一 件很困难的事。少数的化学试剂，如α-异硫氰酸苯酯在严格控 制的条件下可对α-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε-氨 基。由于酶蛋白可以将两个极相似的基团区分开来，所以可利 用酶蛋白的这一特异性对蛋白质分子的功能基团进行特异性修 饰。 在天然状态下，蛋白水解酶是催化肽键的水解，其作用机制是 酶的活性位点首先被一羧基酯化（此羧基来自于被切开的肽键 ），所产生的酰化-酶中间体随之通过水分子的亲核攻击而分解 ：
蛋白质的修饰和表达
第九讲 蛋白质的修饰和表达一、功ຫໍສະໝຸດ 基团的特异性修饰 1. 多位点取代
第一节 23蛋.. 白单次一级质的取修限代饰制性取代
的化学途径
第二节 蛋白质改造
的分子生物学途径
二、基于蛋白质片段的嵌合修饰
1. 嵌合第蛋三白质节—非重共价组缔蛋合白系统质
2. 3.
二嵌硫合的键蛋表与 白嵌质达—合通蛋过白化质学的激形活成形成肽键
第一节 蛋白质修饰的化学途径
■ 一、功能基团的特异性修饰
在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条 件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特 别容易产生有用的取代。因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质 分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修 饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。 对于氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有 差别，但在化学上很难将肽链的α-氨基或α-羧基基团与侧链上的 氨基或羧基相区别。 很多在临床上重要的肽其C末端是被酰化的。但当用重组的方 法得到这些产物时，其C末端是自由羧基。在自然界能进行这种 酰化作用的氧化酶体系很难实用化。寻找一种有效的方法，使C 末端的谷氨酸和天冬氨酸酰胺化，而不作用于处在肽链中的谷 氨酸和天冬氨酸仍是努力的方向。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
★ 2. 单一的或限制性取代
特异性的C 末端取代是另一类反应：
通常在水溶液中，由蛋白水解酶所催化的反应以压倒的优势 向水解方向进行。因为①在反应基质中水分子具有高活性；② 在相当宽的pH值范围内，新释放出的氨基和羧基具有解离倾向 。如果要使式(3-3)或式(3-4)的反应逆向进行，通常要耗费大量 的能量去抑制这些荷电的倾向。如果所生成的产物沉淀，根据 质量作用的原则将推动此反应向着合成方向进行。但当产物是 大分子时，产物与底物之间在溶解度上的差异很小，利用某些 巧妙的生物学上特异亲和过程来捕捉回收产物的研究甚少。
★1. 多位点取代
※(3)其他的侧链取代
羧基的甲基酯化一般可以在室温下将蛋白质加入到含有乙酰 氯的无水甲醇中来完成。由于反应产生盐酸，需将反应物及时 地稀释到冰水中，小心地用碱中和盐酸以使多肽或小分子蛋白 质活力得以保持。 半胱氨酸出现在蛋白质分子中的概率比其他氨基酸要小。相 对于其他功能基团而言，巯基有着十分不同类型的化学反应， 因此半胱氨酸残基是一个很好的靶位，利用这一靶位可以将少 数的取代基团引入到蛋白质分子的确定位置。当一对半胱氨酸 通过二硫键相连时，通常可加入二硫苏糖醇之类的还原剂或通 过磺酸氧化将其打开。用磺酸氧化的方法往往比简单还原的方 法要好，因为磺酸氧化形成的半胱氨酸的磺酸化残基对氧化作 用很稳定，而且可以通过巯基将其还原成自由琉基。
★1. 多位点取代
※(2)亚氨代乙酰基
绝大多数氨基取代反应至今尚无可靠方法将α-氨基和ε-氨基区 分，但亚氨代乙酰化反应是一特例，尽管对α-氨基和ε-氨基的 区分尚不完美。当ε-氨基几乎完全被亚氨代乙酰基取代时，α氨基在很大程度上可不被修饰。被亚氨代乙酰基取代的氨基仍 可解离。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持其在水溶液中的可 溶性，其性质与修饰前一样或相近，因此通常在修饰后这一基 团可不必从蛋白质分子上去除。只有在处于与蛋白质活性相关 的赖氨酸残基的侧链被修饰后，导致蛋白质活性丧失。 然而，亚氨代乙酰化反应在较低pH值下可形成烷基亚胺， N-烷基亚胺可进一步与赖氨酸侧链产生交联，从而影响被修饰 蛋白质的活性。因此，在对ε-氨基进行修饰时，要适当地控制 反应条件，使反应向着形成Nε-乙酰亚胺化的反应进行。