Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶
末端转移酶
碱性磷酸酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
（三）目的基因
目的基因 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
• cDNA
• 基因组DNA
（四）基因载体
定义
为携带目的基因，实现其无性繁殖或 表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
（二）工具酶
• 限制性核酸内切酶
• DNA聚合酶Ⅰ
• 逆转录酶
• T4DNA连接酶
• 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成
PCR产物
开环载体DNA
限制酶消化 连接酶
目的基因
转化 体外包装，转染
重组体
带重组体的宿主
筛选
表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
目录
第二节 转基因技术与核转移技术
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
二、重组DNA技术基本原理
克隆基本过程
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体菌
技术水平：分子克隆
细胞克隆
即DNA 克隆
个体克隆（动物或植物）
DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传
物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然
的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我
复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化
或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子
细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。
配伍末端连接
非配伍末端连接
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌（从大肠杆菌K-12改造） 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 导入方式 转化
转染
感染
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准
• 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有 多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
（二）克隆载体的选择和构建 若将外源基因连接到复制子(基因载体) 上,外源DNA就可以作为复制子的一部分 在受体细胞内复制. 在基因克隆中基因载体的选择与构建是 一项技术性很强的工作,直接影响到基 因克隆的成败.
（三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接
方式：(1)同一限制酶切位点连接
(2)不同限制酶切位点连接
1. 质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些 遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
2. 噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
EMBL系列（臵换型，适用基因组克隆）
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列
外源基因与载体的连接
重组体的筛选
克隆基因的表达
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
目录
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章）
弄清基因的生物学功能,才能明确基因 在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生 的分子机制。常用的基因功能研究技术包 括： （1）DNA克隆技术 （2）转基因技术和核转移技术（动物克隆） （3）基因敲除技术 （4）反义技术 （5）RNA干涉技术
第一节 DNA克隆技术
（一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子
宫，使之发育成个体。
转基因——被导入的目的基因
转基因动物(transgenic animal)
——目源基因 在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一 类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激 素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体 比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项 高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突 破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。
也称基因克隆或重组DNA 。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等 基因工程(genetic engineering) —— 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，
又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）