鱼类转基因技术研究进展高崇西南大学水产系，重庆荣昌402460摘要：近年来，随着分子生物学研究的进展，动物转基因技术得到了长足发展，基因转移的研究为鱼类遗传育种开辟了一条新的途径。
本文从转基因鱼的构建机理、方法及各自的优缺点等方面，阐述了鱼类转基因技术的研究进展。
关键词：鱼类；基因转移；研究进展鱼类是脊椎动物门中种类最多的一个类群，其怀卵量大，体外受精，体外发育，易于操作和观察，易于培育和饲养，是发育生物学研究的良好试验动物。
鱼又是人类的重要蛋白质来源，人们一直在寻求和培育生长快、饵料省、抗逆性强的养殖对象，基因工程技术为这一目标开辟了一条新的途径[1]。
近年来，作为分子生物学领域中极具潜力的技术之一，转基因生物技术应用在全球范围内飞速发展起来。
传统生物技术是借助自然选择或控制繁殖的方法进行物种内的基因改良，而转基因技术则是一种物种间的基因改良。
1984 年中国科学院水产生物所朱作言等将小鼠金属螯合蛋白基因与调控序列和人生长激素基因的DNA 注射到鱼的受精卵核内，培育出生长速度快的转基因鱼，从而证明了外源基因可以在受体鱼内螯合、表达、促生长，并通过性腺传递给子代，建立了世界上首例转基因鱼模型[2]。
随后，美国、英国、加拿大等数十个实验室先后展开了鱼类基因转移的研究，并取得了一定成果。
转基因鱼的研究成功展示了鱼类基因育种研究的广阔前景，并带来了多方面的潜在价值。
1 转基因鱼研究概况在一定条件下，借助基因工程技术将外源基因通过生殖细胞或早期胚胎导入动物个体染色体上的过程称为转基因作用(transgenesis) ，所转移的基因即为转移基因(transgene)，而含有转基因的鱼类称作转基因鱼(transgenic fish) [3]。
鱼类基因转移的研究大体可以分为以下3个阶段:1.1 转基因鱼的起步阶段1984～1990 年，这一阶段的研究主要集中在基因导入技术的完善，鱼类基因及调控元件的克隆及基因和基因产物的检测技术等方面。
1.2 转基因鱼的发展阶段1990 年至今，多个研究单位用全鱼基因元件进行转基因鱼研究，而且世界上开始对2 个以上的转基因鱼进行经济性状、生态影响和食用安全性评价[4]。
1.3 转基因鱼的应用阶段这个阶段正在到来，在外源基因定向整合技术达到可在鱼类个体上应用之前，用个体选择与分子检测相结合的技术，筛选出外源基因可稳定遗传又具有所需表现型的转基因鱼群体，建立转基因鱼品系，并证实其生态与食用安全性之后，就可推广应用于实际生产[5]。
2 鱼类基因转移的主要方法2.1 显微注射法即在显微镜下借助显微操作将直径几微米的玻璃插入受精卵原核或核附近的细胞质中，注入一定量的外源基因，注射后的受精卵于室温下在生理盐水中发育成鱼苗。
显微注射法(Microinjection) 是目前广泛应用、效果较好的一种方法[6]。
现在常用的3 微\注射法: ①从受精孔将DNA 溶液注入卵中，简称MP 法; ②在受精卵刚受精后卵壳尚未变硬时直接注射，简称EI 法; ③用金属针在卵壳上打一个孔，再进行显微注射，简称LI 法[7]。
杨隽等利用PCR 技术删除大马哈鱼(Oncorhynchus keta)生长激素基因的启动子序列，通过基因重组构建全鱼基因，以融合全鱼基因为外源基因，通过显微注射将其线性片段导入鲫鱼受精卵内，研究其整合与转录效率。
结果表明:全鱼基因在鲫鱼基因组中的整合率为36.4 %，对转基因阳性鱼的RBA 样本进行Northern 印迹杂交检测，转录率为25 %。
Fernandez 报道，将RSV212TR 启动子与鳝生长激素GH cDNA 由受精孔显微注射入斑马鱼( Danio rerio) 受精卵中，胚胎孵化率平均达32 %。
处理主要用于生长研究与整合分析，通过点印迹与Southern 印迹发现信号呈阳性反应，进一步证实外源基因与鱼体基因组的整合[8]。
显微注射法的优点很多，转化频率高达20 %。
通过显微注射获得转基因鱼不是很困难，但由于人工操作受实验者技术和熟练程度的影响很大，一次能够处理的卵很少，对细胞损伤很大，死亡率较高，而且耗时费力[9]。
2.2 精子载体法以精子作为外源基因的载体，通过人工受精将外源基因导入动物胚胎，从而将外源基因带入子代基因组中而实现基因转移。
在受精过程中，精原核能自动找到卵子中的卵原核，其准确性之高远非至今任何精密仪器所能比拟。
这种方法非常简便、成本低廉、便于筛选，成为近年来转基因动物研究的一个热点[10]。
目前，精子载体制作转基因鱼主要有3 种方法：2.2.1 直接混合法在受精前将精子直接加入事先配好的保存液中，然后与外源基因混匀，温育半小时后按常规方法受精。
2.2.2 脂质体法将外源DNA 与精子混合培养之前用脂质体包裹，脂质体自发地与DNA 形成脂质体- DNA 复合体。
这种复合体比较容易和精子细胞质融合，从而进入细胞内部，同时脂质体的包裹还可防止核苷酸酶的降解以及防止DNA 被稀释。
2.2.3 电穿孔法又叫电脉冲。
该方法的基本原理是利用外部高电压短脉冲使细胞膜的结构改变，使之产生可逆的孔隙或孔洞，一定大小的分子包括DNA 可通过孔隙或孔洞进入细胞[11]。
电穿孔法已经在微生物、哺乳动物和植物原生质体基因转移中得到广泛应用，现在又开始用于鱼类基因转移。
钟家玉等将稀有鲫(Gobiocypris rarus) 精子与重组质粒PGAHLFc 线性DNA 混合温育，经电脉冲处理后卵子受精，孵化出苗，从鱼苗中提取DNA 经PCR 检测，25.5%～66.7 %的鱼带有外源基因。
谢岳峰等以泥鳅脱膜受精卵为材料，电穿孔转移外源基因，获得了10 %的转基因泥鳅[12]。
电穿孔法的优点是操作简便，一次可以处理大批受精卵。
缺点是外源基因的导入是随机的，且转移的频率较低。
然而，最近的资料表明，该方法所获得的转基因鱼存活率及外源基因整合率均达到显微注射法的水平[13]。
2.3 基因枪法又名高速钨微粒子轰击法或粒子枪法(Particle gun) 。
基因枪法是利用DNA 包裹在钨微粒子上面，通过高速轰击受体细胞以达到把外源DNA 转移的目的[14]。
该方法在植物细胞中使用得较多，鱼类也有成功的报道，如Zelenin 等用β2半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶基因序列的质粒DNA 包裹钨微粒子，高速轰击欧洲泥鳅(Misgurnus fossilis) 、虹鳟鱼和斑马鱼受精卵，有70 %的卵受轰击后存活[15]。
PCR 扩增和Southern 杂交结果，在G418 处理后存活的斑马鱼总DNA 中检测到了新霉素磷酸转移酶基因序列。
中科院海洋所的刘志毅等用基因枪法将外源GFP 基因成功地导入中国对虾(Penaeus Chinensis) 体内并有相应基因产物表达，获得了转基因对虾。
2.4 逆转录病毒感染法此类病毒是RNA 病毒的一种，进入宿主后从RNA 逆转录成DNA ，并结合到宿主细胞的染色体上，这种纳入病毒基因的细胞染色体内就存在了病毒基因。
如果把目的基因整合到病毒染色体上，用改造的病毒侵染宿主细胞就有可能向细胞内导入外源基因[16]。
这种方法已广泛应用于转基因动物模型的基因表达机制、基因产物、细胞缺陷校正和遗传病基因治疗研究等诸多领域。
Elwood 等将GFP基因插入逆转录病毒LTR 区，构建了可以进行荧光蛋白表达的逆转录病毒载体[17]。
逆转录病毒感染法的优点是无论在体外还是在体内，其宿主的范围十分广泛。
逆转录病毒为直接保持宿主基因组中一定结构的原病毒，可被整合并与染色体上其他基因一起活动。
插入的外源DNA 可达10 kb ，适用超长基因转移。
逆转录病毒通过感染在受体细胞中进行外源基因的高效转移和筛选。
该方法的缺陷在于载体病毒DNA 序列有时会影响外源基因在受体动物中的表达，特别是载体病毒导入受体动物细胞后的安全性令人担忧[18]。
3 转基因鱼的安全性及遗传稳定性转基因鱼的安全性主要是指食用安全和生态安全两方面。
转基因鱼引发的有关潜在性风险，即食品安全、遗传以及生态安全性已越来越受到各国政府和人民的关注。
由于转基因鱼尚处于试验性研究，还没有形成商品化规模，因此，对于食品安全性问题的报道还不是很多[19]。
朱作言以国际上拟定的基因工程食品安全性评价原则为标准，率先对“全鱼”基因CAgcGH基因的食品进行了评价，认为转基因“全鱼”CAgcGH基因的食品安全性等级可归于一级[20]。
闫学春等对转牛(羊) 生长激素基因的工程鲤的安全性问题也进行了试验论证，其结果是对食用动物猫无副作用[21]。
4 展望鱼类基因转移不仅利于研究，且具有重要的经济价值。
①提高渔业经济效益，包括增加生长速度、商品重、净肉率，提高饵料转化率，改善鱼抗病和抵御恶劣环境条件的能力等。
②改善品质，包括外表、肉色、肉味和脂肪酸成分等。
③用作生物反应器，生产药品。
④作为实验模型进行基础研究，探讨发育、生长、繁殖等机理。
所以，鱼类转基因研究具有重要的意义和广阔的前景[22]。
我国是世界水产大国，将转基因等现代生物技术引入传统的水产养殖中，已成为必然的发展趋势。
快速生长转基因鱼的成功研制，展示了转基因技术在水产养殖中的广阔前景，更重要的是，转基因技术将为日益频发的养殖病害防治提供有力的支持[23]。
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