广东医学 2019 年 9 月第40 卷第 18 期 Guangdong Medical Journal Sep. 2019, Vol. 40, No. 18・2563・基石出硏究条件性骨细胞Tscl 基因敲除小鼠的初步研究：胡乐，刘文张武镐张月南方医科大学基础医学院（广东广州510515）【摘要】目的 构建骨细胞九cZ 基因条件性敲除小鼠，并进行表型鉴定，为进一步研究TSC1在骨细胞 中飽作用奠定基础。
方法 利用Tscl"和DMP\-Cre *转基因小鼠进行饲养和杂交;对繁殖产生的第1代小鼠进行基因型鉴定,获得Tscl 问-DMPl-Cre * ,待其成年后，同Tsc 严皿小鼠合笼，得到第2代小鼠，通过 PCR 鉴定出基因型为Tscl" DMP1 - Cre * ；此为本实验所需要构建模型小鼠。
应用H-E 染色、光学显微镜观察10周龄小鼠骨细胞的改变。
结果2种转基因小鼠繁殖产生的第2代小鼠基因型符合孟德尔遗传定律，交配后获得Tsc 严皿DMP1 - Cre *小鼠。
TscZ 基因通过Cre/loxP 系统被成功敲除。
结论 该方法成功构建可以在骨细胞条件性敲除九“基因的小鼠，并进行敲除后鉴定。
*国家自然科学基金青年科学基金资助（编号:31600964）△通信作者。
张武镐，E-mail ： smuzhangwj @ qq. com ；刘文，E- mail : 1402241007 @ qq . com【关键词】TSC1； Cre/loxP 系统；条件性敲除；骨细胞【中图分类号】R394.3；Q812【文献标志码】ADOI ： 10.13820/j. cnki. gdyx. 20186808A preliminary study of conditional osteocyte Tscl knockout mice. HU Le , LIU Wen , ZHANG Wu - ju, ZHANGYue. School of Basic Medical Sciences , Southern Medical University , Guangzhou 510515 , Guangdong , ChinaCorresponding author : ZHANG Wu -ju, E - mail : smu^iangivj@ qq. com ； LIU Wen, E - mail : 1402241007@ qq. com[Abstract ] Objective To generate and phenotypic identify osteocyte Tscl conditional knockout mice, and to lay afoundation for further study on the role of TSC1 in osteocyte. Methods心小"°〃处 and DMP1 - Cre * transgenic micewere bred and hybridized. The genotypic identification of the first generation offspring was performed , and Tscl^ox/ ~ DMP1 -Cre + mice were acquired. After crossing with Tscl fl ，＞x/^ox mice, mice with Tscl^7^ DMP1 一 Cre + were identified using PCR. The morphologic changes in osteocyte of Tscl Jlox/flox DM P l - Cre + mice and wild type ( WT) mice aged 10 weekswere observed using H-E staining and optical microscope. Results The genotype of the second generation offspring re produced by two kinds of transgenic mice was in accordance with Mendel's law of inheritance , and Tscl^^ DMP1 一 Cre + mice were generated. Tscl gene was successfully knocked out by using Cre/loxp recombination system. ConclusionHomozygous mice with osteocyte Tscl gene conditional knockout are successfully generated , which serve as ideal model for functional study of TSC1.[Key words ] TSC1 ； Cre/loxP recombination system ； conditional knockout ； osteocyte哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（the mechanistic tar get of rapamycin , mTOR ）是一种至少由2个明显的 多蛋白复合体组成的高度保守的丝氨酸-苏氨酸类激酶，是调节细胞生长、代谢、增殖、凋亡的重要因素⑴。
结节硬化症基因1（ tuberous sclerosis com-plex,TscZ ）突变会造成结节硬化症（TSC ）,这是一种严重的常染色体显性遗传病，因此Tscl 基因的功能受到了广泛的关注[2-3]o TSC1是mTOR 的上游抑 制因子⑷。
有研究表明，7WZ 基因缺失，会导致多 种严重疾病，且不同模式动物上不同细胞缺失，会导 致不同疾病。
小鼠乳腺上皮Tscl 基因的缺失会抑制乳腺导管发育⑸，小鼠软骨细胞Tscl 基因缺失会导致小鼠软骨发育不良、体长缩短⑷。
TscZ 基因敲除显著促进猪颗粒细胞增殖，抑制细胞凋亡切。
小 鼠Tscl 基因缺失导致耳蜗毛细胞早发性死亡，从而 加速听力丧失，其耳蜗表现出氧化应激和抗氧化防御功能受损的特点⑻。
但TSC1在骨细胞中的作用很少被了解。
为了进一步了解TSC1的作用，本课 题组从2015年2月至2018年8月，利用Cre/loxP 位点特异性重组酶系统，构建条件性骨细胞Tscl 基 因敲除小鼠,为后续研究提供动物模型。
1材料与方法1.1材料1. 1. 1 实验动物 Tsc 严曲（品系号：Tscl < tmlDjk >/j - 005680）小鼠购自美国Jackson 实验莹,DMP1 - Cre + （品系号：Tg （ Dmpl - cre ） ljqfe/•2564•广东医学2019年9月第40卷第18期Guangdong Medical Journal Sep.2019,Vol.40,No.18BwdJ-023047)小鼠由上海南方模式生物科技发展公司从美国Jackson实验室引进。
小鼠品系均为C57BL/6J。
繁殖与保种用野生型C57BL/6J小鼠(WT)购自南方医科大学实验动物中心。
引种后于南方医科大学实验动物中心在无特定病原体环境下饲养。
按照SPF级动物饲养标准饲养实验小鼠，环境温度为20~25T，湿度为40%-70%。
Tsc严恥小鼠为纯合子交配繁殖,DMPZ-Cre+小鼠为DMP1-Cr/八杂合子与野生型小鼠交配繁殖。
1.1.2主要试剂蛋白酶K购自美国Promega公司,DreamTaq PCR mix购自美国Thermo公司，琼脂糖粉末、DNA marker,EB替代物购自广州马可生物科技有限公司，PCR引物为上海英潍捷基有限公司合成，其他常用试剂均为国产分析纯。
鼠尾基因组DNA裂解液为自行配制，配方如下：50mmol/L KC1,2mmol/L MgCl2,10mmol/L Tris-HC1(pH= 7.4),0.1mg/mL gelatin,0.45%NP40,0.45% Tween-20,200)jLg/mL蛋白酶K。
1.2方法1.2.1条件性骨细胞TscZ基因敲除小鼠策略与流程基于Cre/loxP原则，Tsc严阿小鼠和DMP1-Cre*小鼠交配产生Tscl^-DMP1-Cre*及TsclT DMP1-Cre-2种子代;对繁殖产生的第1代小鼠进行基因型鉴定，获得TsclT DMP1-g 与TsclT小鼠杂交，得到第2代小鼠，通过PCR 反应鉴定其基因型(图1-A)。
在条件性骨细胞Tscl基因敲除小鼠的体内，骨细胞中缺失Tscl等位基因，而其他细胞中仍然含有7\＜严"加等位基因(图1-B)。
ADMPl-CreXB在骨细胞中等位基因缺失在体内其他细胞中的Zkc严曲等位基因A：敲除小鼠宏观繁殖流程;B：敲除小鼠基因改变图1条件性骨细胞Tscl基因敲除小鼠策略与流程1.2.2小鼠基因组DNA提取取3〜4周龄的小鼠，剪取鼠尾组织约0.2cm3置于1.5mL离心管,加入150piL鼠尾裂解液，放入55%金属浴中12h 进行充分裂解。
放入96%金属浴，使裂解液中的蛋白酶K失活，之后进行12000r/min离心10min,取上清作为基因鉴定的DNA模板，-20七保存备用。
广东医学2019年9月第40卷第18期Guangdong Medical Journal Sep.2019,Vol.40,No.18・2565・1.2.3九cZ基因组的基因型鉴定使用恥“弘〃“引物(表1)扩增鼠尾基因组DNA,鉴定其是否含有loxP位点。
进行PCR反应。
反应体系(总体积20 |1L)：2x PCR mix10»L,上游引物2pL(终浓度: 100|imol/L),下游引物2|xL(终浓度：100^mol/ L),模板4pL,超纯水2p.L o PCR反应程序：(1) 94T预变性3min；(2)94七变性40s；(3)65t退火45s；(4)72T：延伸1min；(5)72*C延伸2min,其中(2)-(4)循环37次。
以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，含有loxP位点的Tscl基因扩增大小为227bp,而野生型Tscl基因扩增大小为193bp。
1.2.4Cre重组酶转基因的鉴定使用DMPZ-Cre+引物(表1)扩增鼠尾基因组DNA,鉴定其是否含有Cre重组酶。
进行PCR反应。
反应体系(总体积20|xL)：2x PCR mix10piL,上游引物2|jl L(终浓度：100pmol/L)，下游引物2jxL(终浓度：100 jimol/L),模板4pL,超纯水2讥。