中国动物传染病学报 2010,18(3):66-72Chinese Journal of Ani m al I nfecti ous D iseases・简报・两种荧光定量PCR 方法检测猪瘟病毒的比较及应用袁雪梅1,2,陈 宁2,陈 宇3,王 萍1,童 超2,李得江2,万 婧2,李肖梁2,方维焕2(1.江西农业大学动物科学技术学院,南昌330045;2.浙江大学动物预防医学研究所浙江省动物预防医学重点实验室,杭州310029;3.农标普瑞纳(嘉兴)饲料有限公司,嘉兴314002)摘 要:根据猪瘟病毒(Classical s wine fever virus,CSF V )5θ端非编码区保守区域,设计猪瘟病毒特异性的引物和探针,建立了基于SY BR Green 和Taq M an 探针的两种荧光定量PCR 检测方法。
灵敏性和特异性试验结果表明,两种方法能够特异性地检测出不同型的猪瘟病毒,而对同属的牛病毒性腹泻病病毒以及其它一些主要猪病病原检测结果均为阴性。
两种方法对猪瘟病毒C 株的检测下限均为101T C I D 50,均高于常规的套式PCR 。
用携带该基因片段的重组质粒为模板进行检测,SY BR Green 方法的检测下限为3×100cop ies,比Taq Man 探针方法更加灵敏(3×101cop ies )。
应用建立的SY BR Green 方法对2009年采集于浙江地区不同猪场的20份病猪样品进行CSF V 检测,有8份样品为阳性,与套式PCR 方法检测结果一致。
进一步应用SY BR Green 方法对不同感染阶段细胞内病毒RNA 复制水平进行检测,与病毒滴度的结果基本一致。
因此,本研究建立的SY BRGreen 荧光定量PCR 检测方法能够应用于组织和培养细胞中猪瘟病毒的检测。
关键词:猪瘟病毒;5θ非编码区;荧光定量PCR 中图分类号:S852.659.6 文献标识码:A文章编号:1674-6422(2010)03-0066-07收稿日期:2010204222基金项目:杭州市科技创新服务平台项目(20082332Y03)作者简介:袁雪梅,女,硕士研究生,预防兽医学专业通讯作者:方维焕,E 2mail:whfang@zju .edu .onCOM PAR I S O N AND APPL I CAT I O N O F S Y BR GREEN AN D TAQ M ANBASED REAL 2T IM E PCR ASSAY S FO R D ETECT I O N O FCLASS I CAL S W INE FEVER V I RUSYUAN X ue 2m ei1,2,CH EN N ing 2,CH EN Yu 3,W AN G Ping 1,TON G C hao 2,L I D e 2jiang 2,W AN J ing 2,L I X iao 2liang 2,FAN G W ei 2huan2(1.College of A ni m al Science,J iangxi A gricultural U niversity,N anchang 330045,China; 2.Zhejiang Provincial KeyL aboratory of Preventive V eterinary M edicine,Institute of Preventive V eterinary M edcine,Zhejiang U niversity,Hangzhou 310029,China; 3.A gribrands Purina Feedm ill Co .,L td,J iaxing 314002,China )Abstract:SY BR Green and Taq Man p r obe based quantitative real 2ti m e PCR (qRT 2PCR )assays targeting the conserved 5θ2UTR regi on were established for detecti on of classical s wine fever virus (CSF V ).The t w o assays were capable of s pecifically detecting different gr oup s of CSF V,whereas bovine viral diarrhea virus and a nu mber of other porcine viruses were tested negative .The detecti on li m it was 101TC I D 50f or both assays on the vaccine C 2strain,more sensitive than that of conventi onal RT 2nested PCR.U sing the recombinant p las m id containing the 5θ2UT R gene as te mp late,the detecti on li m it was 3.0×100and 3.0×101cop ies for SY BR Green and Taq Man based qRT 2PCR,res pectively .Out of 20sa mp les of diseased p igs collected fr om Zhejiang p r ovince in 2009,8sa mp les were positive f or CSF V by SY BR Green based qRT 2PCR,which was consistent with those using RT 2nested PCR.The SY BR Green based qRT 2PCR was further app lied t o detecti on of viral RNA in PK 215cells infected with CSF V.The curve of accu mulated viral RNA was in agree ment with the infectivity titer at different ti m es post 2infecti on .Theref ore,the SY BR第18卷第3期 袁雪梅:两种荧光定量PCR方法检测猪瘟病毒的比较及应用・67 ・Green based qRT2PCR is s pecific and sensitive f or detecti on of CSF V in tissue and cultured cells.Key words:Classical s wine fever virus;5θ2UT R;real2ti m e PCR 猪瘟(classical s wine fever,CSF)是猪的一种高度接触性传染病[1],其病原为黄病毒科、瘟病毒属的猪瘟病毒(Classical s wine fever virus, CSF V)[2]。
由于各国对猪瘟的防治工作非常重视,一些国家和地区已先后消灭猪瘟。
但随着目前养猪业的集约化和生猪贸易的全球化,猪瘟对全球养猪业仍构成严重威胁。
近年来,我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化,流行形式以地方性散发流行为主,症状由典型转变为非典型温和型猪瘟,表现为亚临床症状,如:母猪繁殖障碍,新生仔猪先天性感染造成免疫抑制、成年猪隐性带毒等[3-5]。
这些新的流行和发病特点对快速、及时和准确检测该病提出了更高的要求。
国内外对CSF V的常规检测方法有病毒分离鉴定、免疫荧光、血清学检测和RT2PCR等。
但这些方法在时效性、灵敏性和特异性等方面均存在一些不足[6-7]。
近年来发展起来的荧光定量PCR技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点,在病原检测、基因差异表达以及病毒感染的定量检测等方面得到广泛应用。
本研究首先建立了基于SY BR Green和Taq Man探针的荧光定量PCR检测猪瘟病毒的方法,并比较了其特异性、灵敏性和重复性,进而应用SY BR Green荧光定量PCR方法对组织病料和培养细胞中的猪瘟病毒进行了检测。
1 材料与方法1.1 病毒、细胞与菌种 猪瘟病毒包括基因1型的C株和Shi m en株以及基因2型的HZ208和QZ2 07毒株。
猪圆环病毒2型(Porcine circoviruses ty pe 2virus,PC V2)SY4毒株、猪蓝耳病病毒(Porcine rep r oductive and res p irat ory syndr ome virus,PRRS V) JX07毒株、牛病毒性腹泻病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)O reg on毒株、PCV阴性PK2 15细胞、宿主菌DH5α均由本室保存。
1.2 主要仪器与试剂 i Q T M5荧光定量PCR仪购自B i o2Rad公司;ME M培养基购自GI B CO公司;胎牛血清购自四季青公司;小量病毒RNA抽提试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司;连接试剂盒、pMD218T载体和Taq Man探针荧光定量试剂盒均购自TaKaRa大连宝生物公司; SY BR Green荧光定量试剂盒购自T OY OBO东洋纺公司。
1.3 引物和探针的设计与合成 根据Gen Bank 中CSF V5θ端非编码区保守序列的分析,结合其他研究者的结果,用Pri m er exp ress5.0设计引物和探针(见表1),引物由上海I nvitr ogen公司合成,探针由TaKaRa大连宝生物工程公司合成。
表1 CSFV荧光定量PCR的引物和探针序列Table1 Pr i m ers and probe used i n the CSFV rea l2ti m e PCR a ss ays引物名称Pri m ers序列Sequences位置Locati on长度(bp)Length52UT R2U15θ2AGCTCCCTGGGTGGT CT AAGTC1472168a2252UT R2L5θ2CT CCCAGC ACGTGGTGTG ATTT C2832305a2352UT R2U25θ2TGGGTGGTCT AAGTCCTG AGT A1542175a22Pri m er2p r obe2U5θ2CT CCCTGGGTGGTCT AAGT1492167a19Pri m er2p r obe2L5θ2GCT AGGGTT AAGGTGTGT CTT2472267a21Pr obe5θ2F AM2CTG AGT ACAGG AC AGTCGTCAGT AGTTC2BHQ11692196a28β2actin2U5θ2CT CG ATC ATG AAGTGCG AC4742492b21β2actin2L5θ2GTG ATCTCCTTCTGC ATCCTGTC5652587b23 注:a引物及探针在疫苗C株全基因组中的位置;“b”引物在β2actin基因组中的位置 Note:a Locati ons are derived fr om the genome of C2strain(Gen Bank Z46258);“b”Locati ons are derived fr omβ2actin gene (Gen Bank U07786)・68 ・ 中国动物传染病学报2010年5月1.4 标准品的制备 提取疫苗C株的病毒基因组RNA,用引物52UTR2L反转录基因组52UTR片段。