一个PCR体系中：1对引物，1条探针 每个位点需要做至少两管PCR扩增！！！
应用：对微量突变进行检测。
SNP位点检测应用
EGFR基因突变检测方法灵敏度的比较
检测方法/ 检测灵敏度
100%
直接测序法 +++
TaqmanARMS® 焦磷酸测序
法
+++ +++
Taqman QPCR技术
+++
50% ++ +++ ++
NCCN 2012年版临床治疗指南明 确指出：
患者接受吉西他滨化疗前进行RR M1 mRNA检测可提高治疗有 效率和患者生存率。
RRM1 mRNA <1.4 >1.4
No. Patients 8 8
Median Survival 15.5 mos 6.8 mos
P 0.0028
ERCC1表达与铂类药物疗效相关 的临床数据
ABL
骨髓/全血
无T315I突变
乳腺癌
拉帕替尼（ Lapatinib）
赫塞汀
PI3K Her-2
手术/穿刺/内镜 活检/血浆
野生型
病理切片
高表达/表达阳性
基因表达量（mRNA）检测
——指导个体化化疗
可使标准化疗方案得到个体化应用
mRNA检测主要技术特色
采用荧光定量PCR技术，采用内参比 RNA作为质控对照，应用beta-actin 作为内对照，定量检测检测目的基因 mRNA表达水平。
基因EGFR热点突变位点
•EGFR主要突变在：外显子18，19，20，21 •耐药突变：T790M
➢靶向药物西妥昔单抗靶标——K-ras基因检测
野生型 突变型
✓ NCCN明确指出西妥昔单抗（爱必妥）用 药之前须检测K-ras基因突变检测；
✓ K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗 （爱必妥）中获益,反而徒增不良反应危险 和治疗费用；
适用于各种肿瘤组织检测，包括石蜡 标本、穿刺标本、冰冻活检标本等。
国内采用校准RNA（Calibrator R NA）方法进行基因表达定量。
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Q-PCR检测基因表达数据库
基础：>5000例样本 人种：中国患者样本 标准：正态分布 定位：精确到1% 统计：p<0.05
RRM1表达与吉西他滨疗效相关的临床数据
肿瘤治疗相关基因检测
1.肿瘤个体化治疗
肿瘤分子诊断 循环肿瘤细胞
2. 肿瘤个体化治疗 发展趋势
临床上治疗肿瘤的方法
• 患者对药物是否敏感？毒性是否可耐受？ • 患者治疗后转移复发风险有多高？
个体化治疗：医学概念。应用它不仅降低并发症的发生,还
降低医疗费用。
病理分型
肿瘤标准化治疗 Ⅰ期患者：手术/化疗 Ⅲ、Ⅳ期患者：放/化疗+手术
+++
5% -
+++ +
+/-
1% 0.01% 耗时
-
-
>6h
+++
-
1.5h
-
-
>6h
-
-
<2h
费用 低
中等 中等
中等
测序技术发展历程
Ion Semiconductor Sequenci ng Next-Gen Sequencing （2011） （2005以后） Sanger Sequencing （1 977）
✓ 中国人群中K-ras基因突变率15% ！
✓ 15%的病人不应该使用爱必妥！
World J Gastroenterol. 2011 November 21; 17(43): 4779-4786.
基因KRAS热点突变位点
KRAS主要突变在： 外显子2（密码子12，13 ），3（密码10子61）
个体化检测平台
Ion Torrent半导体测序原理
Ion Torrent半导体测序平台及芯片
PI芯片：sequence exomes and w hole transcriptomes（5Gb）
目前成熟的肿瘤分子靶向药物敏感性基因检测
肿瘤类型
靶向药物
基因
样本
疗效佳的情况
非小细胞肺癌
易瑞沙（Iressa） 特罗凯（Tarceva）
克唑替尼
EGFR KRAS
Eห้องสมุดไป่ตู้L4ALK融合
手术/穿刺/ 胸腹水/血浆
手术/穿刺/ 胸腹水
EGFR突变/KRAS野生 阳性
胃肠间质瘤
格列卫（Gleevec）
C-Kit PDGFRA
手术/穿刺/内镜 活检/血浆
C-kit第11外显子突变/PDGFR突变
慢性粒细胞白 血病
格列卫（Gleevec） 达沙替尼(Dasatinib) 尼罗替尼(Nilotinib)
靶向EGFR的抗肿瘤药物
类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（ EGFR －TKI)
作用机制：抑制EGFR胞内区酪氨酸激酶活性， 阻断EGFR信号通路；
药物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替 尼（罗氏）。
类别二：单克隆抗体(mAb)
作用机制：与EGFR胞外区结合，阻断配体与 EGFR的结合；
药物代表：西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗 氏）。
局部晚期患者：手术、化疗、放疗、靶向
分子分型
肿瘤个体化治疗 标本→基因检测→遗传特性 →选择化疗/靶向药物
克唑替尼的靶标——EML4-ALK融合基因
EML4和ALK两个基因分别位于人 类2号染色体的p21和p23带
已发现并确认至少9种EML4-ALK融合基因的突变体： v1、v2、v3a、v3b、v4、v5a、v5b、v6、v7 检测方法：RT-PCR, FISH, PCR-测序等
基因突变检测
——ARMS技术，测序等
ARMS技术——普通PCR
等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，
ASA）建立于1989年，是PCR技术应用的发展，也称扩
增阻滞突变系统（Amplification Refractory Mutation Sy
stem ， ARMS）、等位基因特异性PCR（Allele Specifi
c PCR， ASPCR）等。
方法：
2条正向引物（针对正
常DNA，突变DNA）
1条反向引物
2个平行的PCR反应
普通PCR仪
TaqMan-ARMS技术
TaqMan-ARMS探针技术基于实时PCR平台，结合了ARMS 突变富集和Taqman-MGB特异性荧光检测两种技术。 Taqman-MGB：针对SNP位点特异性扩增的探针，可区分一个碱基的
ERCC1低表达患者，能从铂类辅助化疗中获益.
BRCA1/2表达与铂类药物疗效 相关的临床数据
BRCA1过度表达 •铂类耐药的预测因子 •抗微管类药物的敏感因子
TS高表达影响氟类和培美曲塞药效
• 低TS mRNA水平的肿瘤 患者接受氟类化疗的效 果较好，中位生存期较 长。 • TS低表达的患者对培 美曲赛的疗效好。