No Mannhem Bio－chemisca于1987年将地高辛
标记的有关试剂及药盒投放市场。
• 和其它非放射性标记物一样，地高辛较放 射性标记系统安全，方便、省时间。同时
Image 在敏感性和质量控制方面比生物素标记技
术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单 拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫 蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色 系统），有较好的反差背景。
• 1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利 用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因
Image 定位，创造了原位杂交细胞或组织化学技术。
• Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA 探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首 次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但 当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探 针均采用同位素标记。
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原位杂交技术原理及其应用剖析
No ❖用原位杂交术，可在原位研究细胞合成 某种多肽或蛋白质的基因表达。
❖此方法有很高的敏感性和特异性，可进
一步从分子水来探讨细胞的功能表达及
Image 其调节机制。已成为当今细胞生物学、
分子生物学研究的重要手段。
原位杂交技术原理及其应用剖析
In situ ybridization
Image （DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原
性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探 针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交 探针。
• 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高， 应用不够普遍。
原位杂交技术原理及其应用剖析
• Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细 胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探 针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺 基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克
Image 和液相杂交
❖液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游
离在溶液中。液相分子杂交技术包括吸附 杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复 性速率液相分子杂交等
原位杂交技术原理及其应用剖析
❖固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在
固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，
No 其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另
一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相 杂交包括：
❖菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、 ❖斑点杂交（Dot blot）、
Image ❖Southern印迹杂交（Southern blot）
❖Northern印迹杂交（Northern blot） ❖组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），
即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学 技术
原位杂交技术原理及其应用剖析
原位杂交技术的基本原理
❖利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过
No 碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，
形成杂交的双链。 1.两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键
结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分 子
原位杂交技术原理及其应用剖析
• 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境， 又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学 工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核 酸探针进行原位杂交。
No • Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探 针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功。
• Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛
• 生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是 在病毒学和病理学的临床诊断中。
原位杂交技术原理及其应用剖析
• 上述生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。 另一种叫光促生物素标记核酸技术（1985） ，
No 该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核
酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素 生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、 连结臂和生物素。在强光下，不需酶反应，光敏 生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。
原位杂交技术原理及其应用剖析
核酸探针的分类
No ➢ Aromase gene
➢The rat brain section
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培养细胞
原位杂交技术原理及其应用剖析
原位杂交组织化学技术发展
• 1961年，Hall 液相核酸杂交技术
No • 1969年，Gall 和Pardue 用爪蟾核糖体基因探针 与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞 的核仁中。
No 原位杂交技术
in situ hybridization
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原位杂交技术原理及其应用剖析
核酸分子杂交技术
No ❖在研究DNA分子复制原理的基础上发展起 来的一种技术。两条核苷酸单链片段，通 过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA双链分子
❖按其作用方式可大致分为两种：固相杂交
No 隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。
• 本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺 口平移标记，敏感度也较高。
• 生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立
Image 的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测
了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化 物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞 中的定位。
Image 2.应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、 32P，荧光素、生物素、地高辛等非放射性物 质)DNA或 RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细 胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交 3.用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观
察目的 mRNA或DNA 的存在与定位 原位杂交技术原理及其应用剖析
Image • 光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低， 但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一 个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探 针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度。
原位杂交技术原理及其应用剖析
• 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术 引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer