附 1：细胞计数法
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即 可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作： ①盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 ②制备计数用的细胞悬液：用吸管吸 5 滴细胞悬液到离心管中，加入 5 滴台盼蓝，活细胞不 会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 ③将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入， 要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 ④统计 4 个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看 到镜中出现计数方格后，数出四角的 4 个大铬（每个大格含有 16 个中格）中没有被染液染 上色的细胞数目。 ⑤计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： （细胞悬液的细胞数）/mL＝（4 个大格子细胞数/4)×2×104 说明：公式中除以 4 因为计数了 4 个大格的细胞数。 公式中乘以 2 因为细胞悬液于染液是 1：1 稀释。 公式中乘以 104 因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1mL＝1000mm3 细胞计数要点： ①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 1×107 L-1，如果细胞数目很少要进行离心 再悬浮于少量培养液中。 ②要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 ③取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀， 以求计数准确。 ④数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照 1 个细胞计算。如果细胞压 在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。 ⑤操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 初学者易犯的错误： 计数前未将待测悬液吹打均匀。滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。
生物②班
小鼠骨髓基质细胞系的建立
设计方案
曾鸿雁
小鼠骨髓细胞群细胞系的建立
一、实验目的：
1) 通过培养小鼠骨髓基质细胞，建立小鼠骨髓基质细胞系
2) 了解细胞培养的一般步骤和注意事项，培养无菌操作意识
二、实验原理：
细胞培养：多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和
死亡的细胞。移植到体外后，只要条件适合，依然保持着分裂增殖的能力。利用
这个原理,将小鼠骨髓基质细胞移植到体外培养。通过一定的纯化方法，从原代
细胞得到传代细胞，经过若干代中，部分细胞发生遗传物质的变化成为无限传代
的性质，分离得到细胞系。
培养细胞纯化：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细
胞先脱壁，利用此道理，采用多次差别消化法将上皮细胞核成纤维细胞分离而达
加培养液培养 3) 原瓶加液继续培养 注意：各步骤均在无菌工作室内进行
第五部分 冻存和复苏 试剂：培养基、20%DMSO、台盼蓝 器材：冻存管、血球计数板、离心管、试管、培养瓶、吸管 仪器：-86℃冰箱、离心机、显微镜、水浴锅 步骤： 1. 离心用试管收集对数生长期的纯化培养细胞（如果不是，可更换培养瓶里的
第二部分 原代培养 器材：解剖刀、剪刀、镊子、平皿、注射器、离心机、血球计数板、15ml 离心 管×4、培养瓶×2，冰块 试剂：乙醚、D-Hank’s 溶液、生理盐水 仪器：超净工作台、离心机、显微镜 步骤： 1.取样 1) 超净工作台上的物品：灭菌后的解剖刀、剪刀、镊子、注射器、平皿、冰块 2) 将小鼠用乙醚麻醉后引颈处死（用培养皿盛），在盛有 75%酒精的烧杯中浸
五、仪器器材： （1）培养皿×3、500ml 烧杯×1、棉花、医用解剖器材（剪刀、镊子、解剖刀）、 10ml 注射器、4 号针头、离心管若干、三角瓶若干、25ml 卡式瓶若干、滴管、精 密 pH 试纸、0.22μm 微孔滤膜、血球细胞计数板、标签纸、油性笔、冻存管 （2）超净工作台、CO2 培养箱、高速离心机、高压灭菌锅、显微镜、水浴锅、 -86℃冰箱
培养基，培养 24h），加血清培养基，重悬起细胞 2. 取 0.1mL 细胞计数，计算细胞浓度及冻前存活率 3. 冻存液的配制：取离心管，加入血清培养基，逐滴加入 DMSO 至 20%；用
前配制，待置室温下 4. 取冻存液缓慢逐滴加入细胞悬液中，边加变轻微摇动，至 DMSO 浓度成 10%
止，细胞浓度 1~5×106 个/mL，混匀，分装到冻存管中，标记；留少量做污 染检测 5. 冻存：先将冻存管置于 4℃10min，调节冰箱，-20℃30min，-80℃18h；有条 件的可以将冻存管放到液氮槽中长期储存 6. 复苏： 1) 将取出的冻存管迅速投入 37~40℃水浴中，振荡； 2) 将细胞液吸出到培养瓶中，加培养液离心洗涤 1-2 次，除去冻存保护剂； 3) 将培养液细胞浓度调整到 1×105-2×105 个/mL，常规培养 注意事项：慢冻快苏原理；冻存管若是安培瓶或无螺帽冻存管，小心冻存管爆裂， 若是非螺旋盖冻存管，应注意防止水进入而造成污染
到纯化的目的
三、材料：实验小白鼠
四、药剂及配制：
DMEM 培养基 购买
血清
购买
NaCl
8.00
KCl
0.40
D-Hank’s 溶
液(g/L)
KH2PO4
0.06
Na2HPO4·2H2O 0.06
NaHCO3
0.35
酚红
0.02
75%酒精
量取无水酒精 75 份定容至 100
0.9%生理盐水 称取 9gNaCl 溶于少量无菌水，定容至 1L
第四部分 纯化 器材及仪器：吸管、离心管、培养瓶、显微镜、离心机 试剂：培养基、胰蛋白酶液、EDTA 液 材料：生长良好的传代培养细胞 步骤： 1) 取出细胞培养瓶，用 0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA 液混合漂洗细胞，摇动，
用显微镜观察，等到差不多半数细胞脱落后，停止消化 2) 将消化液用吸管吸出到离心管中，离心去上清，沉淀的细胞转入新培养瓶中，
2、无菌工作室及其内物品的消毒灭菌 （1）超净工作台 检查超净工作台是否正常；用之前用沾了 75%酒精的脱脂棉擦拭，再开 30min 的 紫外照射 （2）小件物品 用牛皮纸（报纸）将小件物品(如镊子、解剖刀等)包裹好放进饭盒里，放进灭菌 锅，其他物品也一并放入蒸汽灭菌锅内，95KPa、121℃下灭菌 30min （3）其他仪器灭菌 3、试剂配制（如上表） 4、器材准备 5、注意： 1) 使用高压灭菌锅时注意正确使用方法，以免引起危险 2) 超净工作室和工作台必须清理干净，以免引起细胞污染
第三部分 传代培养 器材：卡式瓶若干、滴管、洗耳球、移液管 试剂：D-Hank’s 液、胰蛋白酶液、EDTA 液 材料：生长良好的原代培养细胞 步骤： 1、从培养箱中取出培养五天后的培养瓶，用滴管吸掉旧培养液 2、用 D-Hank’s 液洗涤细胞 1 或 2 次，洗去血清和活力弱的细胞【在培养瓶中 滴加 BSS，直接倾倒，重复即可】 3、用胰蛋白酶-EDTA 液（1:1）消化分散贴壁细胞【加入消化液，37℃，数分钟 （看情况而定，显微镜下细胞将要分离呈现圆粒状即可）】 4、加适量含血清的培养液终止消化作用，离心去上清液，加 D-Hank’s 液洗涤 1-2 次 5、轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入培养基，吹打混匀。按比例稀释后接种 到新的培养瓶中培养。
乙醚 NaHCO3 胰蛋白酶液
EDTA 双抗溶液 4%台盼蓝0ml 三蒸水，过滤除菌，分装后-4℃保存。 根据原代细胞的贴壁程度配置，可选 0.08%、0.125%、0.25%， 用量为 1ml/cm2，2ml/75cm2,37℃作用数分钟。【例：准确称取胰 蛋白酶粉末 0.25g，用 pH 为 8~9 的 D-Hank’s 液溶解，定容至 100ml；震荡过夜；过滤（0.22μm 滤膜）除菌，分装；用之前用 NaHCO3 调节 pH 至 7.2 左右。-20℃保存】 准确称取 EDTA 0.02g，用 D-Hank’s 液溶解后定容至 100ml， 高温高压灭菌，分装。-20℃保存。 青霉素：0.007-0.008g/100ml；链霉素：0.01g/100ml；用时加在 培养基里 取 4g 台盼蓝，用 0.9%生理盐水定容至 100ml，过滤，-4℃保存
泡 5min。在超净工作台上分离双侧股骨（培养皿下置冰块），在含生理盐水 的 50mm2 玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织（皿下置冰块）。 3) 剪去骺端。用 10mL 注射器抽取食量 D-Hank’s 液冲洗骨髓腔，将骨髓冲入 培养瓶。 4) 用 4 号针头反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液,，盛在离心管里。 5) 将悬液在 1000r/min 下离心 5min 后收集细胞 2.原代培养 1) 取出部分细胞用显微镜计数【附：血球计数板计数法】 2) 以 1×108/ml 细胞密度接种在 25cm2 卡式瓶中，加血清培养基 3) 在饱和湿度下 5% CO2 37℃恒温培养箱中培养。 3、注意： 1) 超净工作台上操作的基本规范； 2) 离心机的使用方法；
第一部分 实验前准备 1、（新）玻璃器皿的清洗
• 用5%的盐酸溶液浸泡过夜 浸泡
• 用足量的洗衣粉反复刷洗,将瓶壁上的残渍洗干净 刷洗
• 将干燥后的器皿用重络酸钾溶液(重络酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水 浸酸 1L)浸泡过夜
• 将浸酸后的玻璃器皿用自来水冲洗,然后用蒸馏水,最后干燥、待用 冲洗