成纤维细胞的培养
1前言
成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。

根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。

成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。

在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。

不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。

通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。

成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。

由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。

成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。

2材料和方法
2.1材料
玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管
塑料器材：细胞培养板
橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管
滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜
2.2试剂的配制
水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、
2.3方法
2.3.1试剂配制
（1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水
（2) 组织冲洗液：无血清MEM
（3）细胞生长液：含10％FCS MEM
2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。

2.3.3细胞制备过程
碘酊消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，用无血清MEM 冲洗3次，将鸡胚置于无菌平皿内，去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个平皿内，用无血清MEM冲洗3次，剪碎胚体，静止片刻，吸净上清，加入5－10倍无钙胰蛋白酶，并吸入于无菌青霉素小瓶内，用橡皮膏封严瓶口，37 ℃消化至细胞呈毛球样，吸净消化液，加入细胞生长液，将细胞置于细胞培养瓶中，并用大口吸管吹打细胞使之充分分散，分装2个细胞培养瓶内。

4、换液或接毒
细胞于37℃培养过夜，次日换细胞维持液，或单层接种病毒，每日观察CPE。

5、病毒的收获
CPE达到75％时，冻于冰柜内收获。

6、病毒鉴定
（1）免疫学鉴定：HA
3结论
免疫学鉴定的效价是28
4讨论
CEF细胞的制备一般选用9日龄~11日龄的SPF鸡胚,鸡胚日龄不宜过大,否则剪碎组织时候较为困难,而且杂细胞也会较多。

分离CEF的方法主要是以胰蛋白酶和胶原酶的酶消化法为主。

胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，其消化效果主要与pH、温度、胰蛋白酶的浓度、组织块的大小和硬度有关,钙、镁离子和血清均对该酶有抑制作用。

胶原酶适用于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等,在钙、镁离子和血清存在的情况下仍具有活性,因此使用该酶消化后需要清洗细胞。

相对于胰蛋白酶,胶原酶的价格昂贵,增加了试验成本,所以研究中胰蛋白酶应用最为广泛[4]。

参考文献
[1]徐荣辉，饶寒敏，朱雅萍，等.皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用.中华外科杂志[J],
1994，32(3)：190
[2]饶寒敏，徐荣辉，朱雅萍，等.家兔皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用(显微录象与
四环素标记观察)[J].中华骨科杂志，1995，15(5)：295
[3]百度百科.[2010-6-23]./view/88142.htm?fr=ala0_1.
[4]朱国坡，周晓丽，郭延峰，等.鸡成纤维细胞原代培养及应用[J].动物医学进展，
2010，31(3)：114-116.。