低分子量及寡聚玻璃酸郭学平，凌沛学，张天民目前临床上应用的玻璃酸（又称透明质酸，HA）制剂，如眼科手术用黏弹剂、治疗关节炎的关节腔注射液、术后防粘连制剂、滴眼液等，所用HA 的平均分子量一般为50万～500万。
低分子量HA（LMW-HA）的分子量范围尚无统一标准，一般为1万～50万。
而HA寡聚糖（oligosaccharides of HA，简称oligo-HA）为分子量在1万以下，单糖残基数量为2～40（一般为4～16）的HA分子片段。
LMW-HA还属于大分子多糖范畴，在物理性质和生物活性方面与普通HA接近，而oligo-HA属于小分子多糖，其性质与普通HA有很大不同，甚至具有完全相反的作用。
人体内源性HA的分子量分布较宽，从高分子到寡聚糖均存在，HA在体内总是经历高分子→低分子→寡聚糖→单糖的代谢过程。
注射到体内的外源性HA也要经历这种代谢过程。
因此HA在不同的代谢阶段，因分子量的不同而产生不同的生理或药理作用。
本文对LMH-HA和oligo-HA的制备方法和生物活性的研究做一介绍。
1 制备方法LMW-HA可在普通HA的制备过程中，先对HA进行一定程度的降解，再进行纯化精制，直接制得LMW-HA。
由于HA降解后，黏度下降，使得过滤等操作容易进行，因此适用LMW-HA的大量生产。
实验室中少量的制备可将HA直接降解制得。
降解的方法有多种，主要为化学降解、酶解和物理降解，见表1。
不同的降解方法各有特点，需要注意的是，除了要得到所需的平均分子量，还要考虑分子量分布范围。
用凝胶色谱法可测定LMW-HA的平均分子量及分布。
平均分子量分为重均分子量M w和数均分子量M n，其比值称为多分散指数（polydispersion index，PD），即PD = M w/M n，PD值越小分子量分布范围越窄。
化学降解法可能对糖链上的基团或断裂处的残基有一定修饰作用，对制得的LMW-HA的生物活性产生一定影响，因此不同降解方法制得的LMW-HA，即使分子量一致，其药理作用或生物活性也可能存在差异。
表 1 HA的降解方法分类方法化学法碱水解，酸水解，氧化降解酶法玻璃酸酶水解、硫酸软骨素酶水解物理法热降解、机械剪切力降解、超声波降解、γ-射线降解、紫外线降解1.1 化学降解法HA的化学降解法主要分为碱水解、酸水解和氧化降解。
日本专利[1]介绍了一种从鸡冠制备LMW-HA的方法，首先将原料磨成糊状，再加水和不同量氢氧化钠（最终浓度0.05～0.15mol/L），50～75℃提取并水解60～150min，再经过滤，氯化十六烷基吡啶（CPC）沉淀等精制过程，分别制得平均分子量为80万、30万、20万、17万、14万的LMW-HA。
但是单用上述碱水解制备分子量低于20万的LMW-HA产率较低，采用先碱水解后酸水解的方法，可提高收率。
如先将鸡冠糊提取液在0.1mol/L氢氧化钠60℃碱水解120min，精制得分子量约30万的LMW-HA，然后用氯化钠溶液溶解成2%的溶液，用盐酸调pH3.5～4.0，85℃加热60～120min，加乙醇沉淀出LMW-HA，经脱水干燥，得分子量为11万～14万的LMW-HA，收率约0.85%（相对于鸡冠），而直接碱水解的收率为0.47%。
再降低酸水解pH，延长时间，提高温度可得到分子量更低的产品。
氧化法所用的氧化剂为次氯酸钠（NaOCl）和过氧化氢（H2O2）等，其主要原理是氧化剂产生的氧自由基使HA链的糖苷键断裂。
杉谷等[2]将发酵来源的HA（分子量约250万），配成1%浓度，分别加入150、300、800ppm的次氯酸钠，30℃反应30~60min，可降解制得分子量为30万、25万和15万的HA。
另外还原剂（如抗坏血酸）也可导致HA降解，但未用于制备LMW-HA，其降解机制尚不明确。
1.2 酶解法酶解法是降解HA温和的方法，最适于制备oligo-HA。
因为化学降解等方法将HA降解成寡聚糖，需要较剧烈的反应条件，如较高的酸、碱浓度等，才能达到高的降解程度。
此时不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖（葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖）残基的结构也可能遭到破坏，如乙酰基被水解掉、单糖六元环断裂等。
当然酶解法也可用于制备LMW-HA。
Mahoney[3]将HA用玻璃酸酶降解，然后经凝胶色谱和阴离子交换色谱纯化分别制得4～34糖，其中4～16糖在糖链长度上是均一的，即纯化得到均一的4、6、8、…16糖；18～34糖是这些糖的混合物。
制备均一的oligo-HA 很重要，分别对几种均一oligo-HA的生物活性进行研究，可以明确某种寡糖的作用，而不是多种寡糖混合物的作用。
1.3 物理降解法加热、机械剪切力、超声波、γ-射线等均可使HA降解。
资生堂株式会社4]用一种高剪切速率的乳化机，处理分子量为180万的HA溶液，30min即可得到分子量为5万或更低的LMW-HA。
其特点是无需加入任何化学物质或酶（降解结束后需除去），所得产品分子量分布范围窄、热稳定性好。
机械剪切力可作用于HA分子链，使之产生张力，导致分子链断裂。
分子链越长，所受的剪切力越强，越易断裂。
分子量在30万以上时，机械剪切作用导致的分子下降速率快，30万以下时，速率减缓。
用超声波处理HA溶液，可显著降低其黏度。
美国专利[5]报道了联合使用超声波和次氯酸钠降解HA的方法。
两种降解方式同时使用可降解制得分子量5000～20000的LMW-HA，分子量分布较窄，PD值控制在1.7之内。
单独使用超声波或次氯酸钠，平均分子量降至5万以下时，PD值无法控制在1.7之内。
热降解也是一种简单的HA降解方法，即将HA干品或溶液在80～121℃加热，调整加热温度和时间可得到不同分子量的LMW-HA。
热降解常与其他方法联合使用。
值得注意的是，HA在干品状态的热降解速率高于溶液状态[6]，Karen等[7]对高温加热后HA溶液黏度的下降有不同的见解，认为黏度下降，分子量（用凝胶色谱测定）并未下降，并提出了低黏度高分子量HA的概念。
2 生物活性研究表明，HA的多种生物活性具有分子量依赖性，LMW-HA或oligo-HA 的某些生物活性，（高分子）HA就没有或具有相反的作用。
2.1 促血管生成作用West[8]等发现3～16个双糖单位的HA片段在体内具有促血管生成作用，在体外可促进内皮细胞的增生。
这种作用具有细胞专一性，对成纤维细胞和平滑肌细胞就无此作用。
而高分子量HA在体外抑制内皮细胞的增生，在体内抑制新血管的生成。
Deed[9]等的体外实验表明，具有促血管生成oligo-HA 可快速诱导动脉内皮细胞相关基因表达水平的提高。
未降解的HA对这些基因的表达无影响。
HA和oligo-HA同时使用时，HA可抑制oligo-HA诱导的相关基因表达。
但先加入oligo-HA 1min，再加入HA，HA的抑制作用就没有了。
相反，若先加入HA，后加入oligo-HA，则HA不可逆转地阻断这些基因的表达和细胞增生反应。
这说明oligo-HA与细胞表面受体的结合，并通过信号传递，诱导相关的表达，从而促进内皮细胞的增生。
oligo-HA可促进内皮细胞合成Ⅰ型和Ⅷ型胶原，这两种胶原在血管生成过程中具有重要作用[10]。
2.2 细胞免疫活化作用Termeer[11，12]等试验表明，只有HA小分子片段（4糖和6糖）可诱导具有免疫作用的树突细胞的成熟化，并促进树突细胞产生白介素、肿瘤坏死因子等细胞因子，而分子量在8万～20万或更高的HA则无此作用。
oligo-HA 的这种作用具有专属性，其他糖胺聚糖如硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素或其降解产物没有这种作用。
在炎症过程中，内源性HA被降解成的小分子片段，对树突细胞和巨噬细胞等免疫活性细胞具有强力活化作用。
这种作用是通过钟状受体-4（TLR-4）介导的，而不是CD44受体。
2.3 促进骨生成作用有专利报道[13]，分子量为2万～6万的LMW-HA可刺激体外培养的骨细胞的增生，增加培养基中骨细胞集落的数目和单个集落的面积。
由此可见关节腔注射HA，不但可以起润滑作用，HA经过一段时间被降解成LMW-HA，还具有促进细胞生长的作用。
2.4 治疗细菌性角膜溃疡临床试验证明[14]，使用含有妥布霉素和LMW-HA的滴眼液治疗细菌性角膜溃疡，与只含妥布霉素的滴眼液相比，可显著缩短愈合时间。
此项研究对开发LMW-HA滴眼液有一定指导意义。
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