一株自养硝化细菌培养条件的优化摘要：针对前期筛选的自养硝化杆菌（Nitrobacter）菌株y3-2，以实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR）测定的菌液终浓度为指标，设计单因素试验和正交试验对其培养基和培养条件进行优化。
结果表明，优化的硝化杆菌y3-2的培养基中CaCO3、Na2CO3、NaNO2浓度分别为0.5、1.0、0.5 g/L。
最佳培养条件为培养温度28 ℃、pH 8.0、摇床转速200 r/min。
优化后硝化杆菌y3-2的发酵周期由优化前的7 d缩短至4 d，菌液终浓度达到4.31×109 CFU/mL。
关键词：硝化杆菌（Nitrobacter）；培养基；培养条件；优化氮素是水体污染源的主要成分之一，水体的脱氮技术已经成为人们关注与研究的热点[1]。
与传统的物理化学脱氮工艺相比，生物脱氮具有成本低、效率高、无二次污染等优势。
现今采用最多的生物脱氮工艺为硝化—反硝化工艺，其中的硝化工艺由硝化细菌（Nitrifying bacteria）完成[2]。
硝化细菌分为自养型硝化细菌和异养型硝化细菌2类，异养型硝化细菌仅占很少一部分，自养型硝化细菌是生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影响污水处理系统的硝化效果和生物脱氮效率[3]。
硝化过程通常由氨氧化细菌（Ammonia-oxidizing Bacteria，AOB）先将氨氮转化为亚硝酸盐，然后由亚硝酸氧化细菌（Nitrite-oxidizing Bacteria，NOB）将亚硝酸盐转化为硝酸盐[4]。
与自养型AOB 一样，自养型NOB具有生长速度慢、自然条件下数量低等特点，这一方面使NOB 的研究较为困难，另一方面也制约了其工业化生产和应用。
因此，研究加快NOB 生长速度的培养方法显得尤为重要[5，6]。
本研究以一株亚硝酸氧化细菌y3-2[7]为出发菌株，对其培养基和培养条件进行了优化，并采用实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time quantitative PCR detecting system，qPCR）计数的方法对其菌液浓度进行计数，以期获得能快速培养硝化杆菌y3-2的方法。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种试验用菌种硝化杆菌y3-2由农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室分离纯化保藏，经16 S rDNA鉴定为硝化杆菌属（Nitrobacter）细菌。
1.1.2 优化前培养基及培养条件优化前初始培养基：MgSO4·7H2O 0.12 g/L、NaH2PO4·2H2O 1.16 g/L、K2HPO4·3H2O 0.33 g/L、MnSO4·H2O 0.007 6 g/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 50 μg/L、无水NaCO3 0.5 g/L、NaNO2 1.0 g/L、pH 7.5，121 ℃、30 min灭菌。
优化前的培养条件为250 mL三角瓶加入50 mL培养基，200 r/min、30 ℃恒温培养。
1.1.3 试剂亚硝酸盐和硝酸盐定性检测试剂[8]：Griess试剂、盐酸溶液、氨基磺酸铵溶液、二苯胺—硫酸试剂，细菌基因组DNA提取试剂盒和Real MasterMix（SYBR Green）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，硝化杆菌qPCR 标准样品为农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室自制。
1.2 方法1.2.1 培养基的优化1）单因素试验。
设计单因素试验分别考察培养基中CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对试验菌株生长的影响。
①CaCO3浓度。
Na2CO3浓度1.5 g/L，NaNO2浓度0.5 g/L，CaCO3浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L。
②Na2CO3浓度。
CaCO3浓度0.5 g/L，NaNO2浓度0.5 g/L，Na2CO3浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L。
③NaNO2浓度。
CaCO3浓度0.5 g/L，Na2CO3浓度1.5 g/L，NaNO2浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L。
每个单因素试验设置3个平行，每天定性检测NO2-、NO3-含量，观察NO3-生成情况，记录NO2-完全硝化所需时间，并对细菌进行计数。
2）正交试验。
设置三因素三水平正交试验考察CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对细菌生长的影响，每个试验设置2次重复。
1.2.2 培养条件的优化采用优化后的培养基培养菌株，设置单因素试验考察培养温度、pH和转速对菌株生长的影响。
①温度。
将种龄为48 h的新鲜菌液以5%的接种量接种到装有50 mL培养基的250 mL三角瓶中（后面摇瓶试验接种方法一致），分别在15、20、25、28、30、35 ℃下恒温培养，pH控制在7.0～7.5，转速设为200 r/min，记录NO2-完全硝化所需时间及菌落数；选择适宜的温度范围进行正交试验。
②pH。
培养基pH控制为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培养温度为28 ℃，转速设为200 r/min。
记录NO2-完全硝化所需时间及菌落数。
③转速。
将活化后的菌种接种到三角瓶中，28 ℃恒温培养，pH 8.0，转速分别为50、100、150、200、250 r/min，记录NO2-完全硝化时间及最终菌落数。
每个单因素试验设置3组平行。
1.2.3 分析方法亚硝酸盐定性检测使用Griess试剂法；硝酸盐定性检测使用二苯胺-硫酸试剂法[8]；菌液浓度定量分析：首先提取收集菌液的基因组DNA，然后使用Real-time PCR定量计数方法进行计数[9]，qPCR反应体系总体积为20 μL，含有Real Master Mix/20×SYBR solution 9 μL、FGPS872（5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′）1 μL（终浓度100 nmol/L）、FGPS1269（5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′）1 μL（终浓度100 nmol/L），DNA模板1 μL，超纯水8 μL。
Real-time PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性20 s，50 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，共循环40次；最后一步设置自动制作溶解曲线。
通过计算机对样品PCR结果和标准样品PCR结果进行对比分析，计算出扩增基因片段的拷贝数，从而推算出样品中的菌体含量。
2 结果与分析2.1 培养基的优化结果2.1.1 不同CaCO3浓度对y3-2生长及硝化作用的影响近年来多项研究表明NOB具有附着生长的特点，有研究者通过此特点对NOB进行固定化，从而提高NOB的硝化效率[10]，本研究以CaCO3为添加物，提供y3-2生长的附着位点，考察其对y3-2生长的促进作用，结果如图1所示。
由图1可以看出，CaCO3对y3-2的生长具有明显的促进作用，其浓度为0.5 g/L时促进作用最佳，菌液终浓度达8.0×108 CFU/mL，而未添加CaCO3的对照组菌液浓度不足 1.0×108 CFU/mL。
此外，CaCO3添加浓度为0.5 g/L时，硝化速度也明显加快，NO2-完全硝化仅需5 d，而对照组需要9 d。
2.1.2 不同Na2CO3浓度对y3-2生长及硝化作用的影响Na2CO3浓度对y3-2生长和硝化作用的影响结果如图2所示。
由图2可知，Na2CO3浓度为1.0～3.0 g/L 时NOB具有良好的生长势，其中1.0 g/L试验组细菌生长情况最好，菌液终浓度最高，且完全硝化NO2-仅需5 d；当Na2CO3浓度小于1.0 g/L时，y3-2生长速度很慢，原因是过低的碳源浓度使y3-2生长不充分，生物量较低。
在氮源浓度一定的情况下，碳源浓度过高致使培养液中碳氮比（C/N）过高，会导致细菌对氮源的代谢利用发生异常，从而细菌繁殖缓慢，因此Na2CO3浓度高于3.0 g/L 时菌液中终浓度较低，NO2-完全转化所需时间也延长。
2.1.3 不同NaNO2浓度对y3-2生长的影响NO2-是NOB生长与繁殖过程中唯一的氮源，它是控制NOB生长的重要因素，不同NO2-浓度对y3-2生长的影响结果如图3所示。
由图3可知，NaNO2浓度为0.5～4.0 g/L时对NOB生长有明显的促进作用，0.5 g/L时y3-2生长速率最快，NaNO2为4.0 g/L时菌液终浓度最大，约为2.0×109 CFU/mL；但随着NaNO2浓度进一步升高，y3-2的生长被抑制，且完全硝化NO2-的时间也逐渐延长。
这是因为NO2-浓度过低使细菌缺乏充分的底物来进行繁殖，而浓度过高时会对y3p 2.2 培养条件优化的结果2.2.1 温度对y3-2生长和硝化作用的影响有文献报道NOB在15～30 ℃具有较好的生长状态和硝化活性[11]。
y3-2在不同培养温度下的生长及硝化NO2-的情况见图4。
从图4可以看出，菌液终浓度随培养温度的升高呈先升高后降低的变化趋势，28 ℃时y3-2的菌液终浓度最高，此时完全硝化0.5 g/L NaNO2所需时间为4 d。
2.2.2 pH对y3-2生长和硝化作用的影响pH不同会导致菌株酶活力的变化，从而使菌体生长和代谢能力发生改变[12]，传统研究认为pH在 6.5～8.0适宜NOB生长，在pH 8.0～8.5范围内NOB硝化效率最高[13]。
pH对y3-2生长和硝化作用的影响见图5。
从图5可以看出，pH为8.0时菌液浓度可达1.68×109 CFU/mL，明显高于其他处理，说明y3-2的最适培养pH为8.0，此时完全硝化0.5 g/L NaNO2所需时间为4 d。
2.2.3 摇床转速对y3-2生长和硝化作用的影响NOB是好氧性细菌，溶氧量对其生长有着重要的影响，一般而言溶氧需控制在2 mg/L以上[14]。
在一定温度下溶氧是装液比（培养基装液量/三角瓶体积）和摇瓶转速的函数，如果装液比固定则转速将直接影响培养基中的溶氧量。
y3-2在不同转速下的生长情况见图6，从图6可以看出，菌液终浓度随着转速的加快先快速升高，当转速达到200 r/min 及以上时菌液终浓度随转速加快而升高的趋势变得平缓，说明转速达到200 r/min 时溶液中的溶氧量已达到细菌最快生长所需的条件，再增大转速也无益于提高细胞浓度，反而消耗过多的能源，增大培养成本。
3 小结与讨论本研究针对一株硝化杆菌y3-2进行了培养基和培养条件的优化，优化后培养液中的菌液终浓度达到了4.31×109 CFU/mL，并且培养时间从初始的7 d缩短至4 d，减少了接近一半的培养周期，为亚硝酸氧化细菌的工业化生产奠定了一定的基础。