消毒技术规范95页到109页2.7 抗（抑）菌效果鉴定试验2.7.1 目的测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用。

常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞留抑菌效果测定试验、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与帖膜试验，可视情况选用。

2.7.2 抑菌环试验2.7.2.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。

试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。

本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的抗（抑）菌效果鉴定。

2.7.2.2 实验器材（1）实验菌株金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（8099 或ATCC 11229）、白色念珠菌（ATCC 10231）菌悬液（见 2.1.2）及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液（2）抑菌剂载体 5mm 直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃烤干2h，保存备用（3）活菌培养计数所需器材见2.1.3（4）微量移液器 5μL～50μL，可调式（5）游标卡尺（6）营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基2.7.2.3 操作程序（1）抑菌片的制备：对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。

每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液 5μL，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置恒温培养箱（37℃）中烤干，或置室温下自然干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为 5mm，厚不超过 4mm 圆片（块），每 4 片（块）一组。

（2）阴性对照样片的制备：取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水5μL，干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本，应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片（块）。

（3）试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×105cfu/mL～5×106cfu/mL 试验菌悬液，在适宜的培养基平板表面均匀涂抹3次。

每涂抹1次，平板应转动 60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。

盖好平皿，置室温干燥 5min。

（4）抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片， 1 片阴性对照样片，共 5 片。

用无菌镊子取样片贴放于平板表面。

各样片中心之间相距 25mm 以上，与平板的周缘相距 15mm 以上。

贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。

盖好平皿，置 37℃恒温培养箱，培养 16h～18h 观察结果。

用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。

（5）试验重复3次。

（6）测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。

测量其直径应以抑菌环外沿为界。

2.7.2.4 评价规定（1）抑菌作用的判断：抑菌环直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。

抑菌环直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。

（2）3 次重复试验（共12个样片）均有抑菌作用结果者，判为合格。

（3）阴性对照组应无抑菌环产生。

否则试验无效。

2.7.2.5 注意事项（1）每次试验均应设置阴性对照。

在报告中亦必须将对照组的结果列出。

（2）接种用细菌悬液的浓度应符合要求。

浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大；浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减小。

（3）应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。

（4）培养时间不得超过 18h。

培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。

（5）抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。

故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。

2.7.3 最小抑菌浓度测定试验（琼脂稀释法）2.7.3.1 原理本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）。

本方法适用于非溶出性抗（抑）菌产品抗（抑）菌效果的鉴定。

2.7.3.2 实验器材（1）实验菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099或ATCC 11229，可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株（2）营养琼脂培养基，制备后经高压灭后，置 45℃～50℃水浴备用，此培养基将用于对照试验（3）磷酸盐缓冲液 0.03mol/L，pH7.2（4）灭菌蒸馏水（5）加样器（1μL～10μL）（6）45℃～50℃水浴恒恒温培养箱（7）吸管、试管、平皿（8）37℃恒温培养箱2.7.3.3 操作步骤（1）抗（抑）菌溶液的配制：以无菌操作取 5mL或 5g（固体研磨后）样品，放入 45mL 灭菌蒸馏水中，充分振荡溶解，配成 10% 的均匀分散的溶液或悬液。

（2）抗菌剂稀释液配制：将已配成 10% 的抗（抑）菌溶液或悬液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，置 45℃～50℃水浴恒温备用。

（3）双倍浓度营养琼脂培养基：制备后经高压灭菌后，置 45℃～50℃水浴备用，此培养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。

（4）含抗（抑）菌液培养基的配制：分别取 10mL 系列稀释的抗菌液加入平皿内。

将在 45℃～50℃水浴中的双倍浓度营养琼脂培养基 10mL，加进平皿内，边加边摇晃平板，使抗（抑）菌液和培养基充分混匀。

（5）用加样器取1μL～2μL（含菌量约为 107cfu/mL 的PBS溶液）菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约 5mm～8mm（每个点菌量约为 104cfu）。

（6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的营养琼脂平板，作为阳性对照。

（7）将接种后的平板放置 35℃恒温培养箱中，倒置培养 18h～24h，观察结果。

2.7.3.4 评价规定菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。

单一菌落生长可忽略不计。

2.7.3.5 注意事项（1）接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度平板依次接种，最后接种对照平板。

（2）为了保证平板受热均匀，培养时平板堆放不得超过4个。

2.7.4 最小抑菌浓度测定试验（营养肉汤稀释法）2.7.4.1 原理本试验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，通过细菌的生长与否，确定抑菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（MIC）。

本方法适用于溶出性抑菌产品最低抑菌浓度的测定。

2.7.4.2 实验器材（1）实验菌株金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），大肠杆菌（8099或ATCC 11229），可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株（2）营养肉汤培养基见附录A（3）稀释液见附录A（4）吸管、试管（5）37℃恒温培养箱。

2.7.4.3 操作步骤（1）按 2.1.2 所示方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液（2）含抗菌剂培养基配制：将抗（抑）菌溶液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，取各稀释度受试液 2.5mL 加入到含 2.5mL 双倍浓度营养肉汤的试管中。

（3）取 0.1mL 含菌量约为 108cfu/mL 菌悬液接种于含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中，作为试验组样本。

（4）以同样方法接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中，作为阳性对照组样本。

（5）取2支含营养肉汤的试管，作为阴性对照组样本。

（6）将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置 37℃恒温培养箱中，培养48h，观察结果。

（7）试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其作用浓度应为 5×105cfu/mL～5×106cfu/mL。

2.7.4.4 评价规定当阳性对照管有细菌生长（混浊），阴性对照管无菌生长（透明），试验用菌悬液的作用浓度为 5×105cfu/mL～5×106cfu/mL 时，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗（抑）菌剂浓度，为该样品对受试菌的MIC。

2.7.4.5 注意事项接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度依次接种。

2.7.5 滞留抑菌效果鉴定试验2.7.5.1 原理本试验通过模拟适合细菌生长、繁殖和可能产生感染的皮肤条件下，使用随机性、双盲的、配对比较的方法，检测抗（抑）菌样品12h或24h的滞留抑菌效果。

2.7.5.2 实验器材（1）试验产品试验品为25套按顺序编号的样品。

每套2块，一块为测试样品皂，另一块为不含抗（抑）菌剂的对照样品（2）不含抑菌剂的洗发液和沐浴液各25瓶（200mL/瓶，试验调整阶段用）（3）不含抑菌剂的香皂 25块（试验调整阶段用）（4）胰蛋白酶大豆肉汤培养基（TSB）（5）胰蛋白酶大豆琼脂培养基（TSA）（6）0.075mol/L的磷酸盐缓冲液（7）70%酒精（8）恒温培养箱（9）金属筒（直径2.2cm、高度3cm）（10）一次性接种环（直径4mm）（11）小塑料碗（直径2.2cm、高2.5mm）（12）胶带（Darapore，3M公司生产）（13）尼龙刮菌棒（14）Triton-X 100 500ml（15）外用抗生素软膏（例如：百多邦莫匹罗星软膏）（16）玻璃弯棒（17）羊血经脱纤维处理（18）金黄色葡萄球菌ATCC 27217（此株金黄色葡萄球菌是一种低毒性、对青霉素敏感、对四环素有抗药性的色素株，曾用于许多试验研究，没有任何严重副作用）。

（19）皮肤消毒剂2.7.5.3 试验步骤（1）调整阶段试验开始前 7d至 14d，志愿者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗发水和沐浴液进行日常的洗手、洗澡。

此阶段持续至少 7d，但不超过 14d。

（2）清洗阶段清洗阶段共 3d，志愿者每天用抗（抑）菌样品清洗一侧前臂，用对照样品清洗另一侧前臂，清洗过程如下：1）先清洗左臂，用流动水（水温应保持在 35℃～37℃）打湿前臂内侧；2）用香皂从手腕至臂肘上下摩擦15s；3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；4）用流动的清水冲洗前臂15s，不要搓擦；5）用纸巾沾干前臂. 不要搓擦；6）重复以上步骤清洗右臂；7）按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂3次，每次间隔至少一个小时，在最后一次清洗之后，需记录好时间，在 12h之后，进行滞留效果检测。

在第9次清洗前臂以后，志愿者不能洗澡、淋浴或洗净前臂，直到试验结束。

清洗前后的两块香皂的重量及志愿者完成清洗的情况，须记录下来。

（3）试验阶段清洗阶段的第四天（最后一次清洗后 12h或24h），将在志愿者每只前臂上划出一个试验区，对试验区进行接种、封包和回收存活细菌，具体步骤如下:1）将金黄色葡萄球菌（ATCC 27217）连续转种3代，取第3代培养物接种于胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）中，在 35℃±2℃的条件下培养 20h ±2h。

然后用胰蛋白酶大豆肉汤适当稀释菌悬液，使菌悬液浓度约为 108cfu/mL～109cfu/mL。

2）细菌接种：在志愿者的每只前臂中间部位（不要在手腕和肘皱褶处），用带有印墨直径为3.00cm的玻璃量筒扣在皮肤上，划分出一个试验区。