细胞大规模培养是指在生物反应器中高密度大量培养细胞用于 生产生物制品的技术
近几十年，人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等 生物制品的需求不断增加，传统方法已不能满足这一需求。因此，迫切需 要建立动物细胞大规模培养技术。自20世纪70年代以来，细胞培养用生物 反应器有了很大的进展，推动了动物细胞大规模培养技术的发展。目前贴 壁培养系统主要有转瓶（管）、微载体系统、中空纤维、玻璃珠等。
动物细胞培养生物 制药
11.5 动物细胞传代培养
动物细胞体外培养： 组织获得与消化、接种、原代培养、传代培养
传代培养：是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细 胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。
通常情况下，传至5~10代以内的细胞称为次代培养细胞，传 至10~20代以上的细胞称为传代细胞系。
统C。ontent design, 10 years experience 微载体系统将传统的一维平面贴附扩展为三维立 体贴附，摆脱了传统的培养瓶（管）的限制。 同时，微载体使利用生物反应器进行动物细胞大 规模培养成为可能，既能满足动物细胞的贴壁要 求，又能充分利用生物反应器的内部空间。
微载体使直径60~250μm的适用 于贴壁依赖型细胞生长的微珠
优点：结构简单、投资少、技术成熟、重复性好、 放大只需简单地增加转瓶（管）数量
缺点：劳动程度大、占地空间大、单位体积提供细 胞生长的表面积小、细胞生长密度低、培养时监测 和控制环境条件受限
11.7.2 微载体培养
1967年，维尔茨（van Wezel）开发了微载体系
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一般情况下，当传至10～50代后，细胞增殖逐渐缓慢，最终完全 停止，之后进入衰退期。
动物细胞培养过程生长曲线
11.5.1 传代培养方法
11.5.2 传代培养过程分析
生长过程经历：潜伏期、指数生长期、减速期、 平台期、衰退期
培养期间，每1~2天需要对细胞做常规检查， 包括：是否污染、细胞生长状况、培养液PH 传代培养过程分析包括细胞形态检查及活力分析与 营养液PH及污染检查。
一个报道的细胞株应包括：培养简历、冻存液、 细胞活力、培养液、细胞形态类型、核型、无污 染检测、物种检测、免疫检测、细胞建立者
11.6.1 分离纯化与保存
体外原代培养一般都是多种类型的细胞混合生长，必须经过细 胞纯化得到单一种类细胞进行功能、形态等研究
1、自然纯化：无法根据实际需求选择细胞，费时费力 细胞因子依赖法
MTT法简单、快速、准确、广泛应用于新药筛选、 细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性试验等方面
营养液PH及污染检查
含血清的新鲜培养液呈桃红色，PH在7.2~7.4之间。 一段时间后，CO2的积累使培养液PH下降，当超出缓冲范围时， 培养液变黄，需要3~4d更换一次培养液。 CO2培养箱能自动控制5%的CO2含量。 培养瓶口盖需拧松或用无菌纱布棉塞以保证透气。
等影响，细胞易老化脱 落
微载体的制作方法
制作方法包括：高温烧结法、聚合物快速凝聚法、高分子材料成球聚合法、锐孔喷 冷冻凝固法
11.7.1 转瓶（管）培养系统
♥一we般lc用om于e小t量o 培us养e 到th大es规e 模Po培w养er的Po过in渡t 阶tem段plates, New Content design, 10 years experience
♥采用专门设计的细胞培养转瓶机和不同规格的转瓶进行培养 ♥有专门设计的旋转系统和不同规格的旋转管 ♥在转管培养的基础上为扩大培养而改进的
概念 优点 缺点
微载体的分类
实心微载 多孔微载体 体
内部具有网状结构的小
细胞能贴附在微载体表 孔，细胞能在微载体内
面生长
部生长
比表面积更大，使细胞
易于细胞在表面贴壁， 免受机械损伤，得到的
机械强度高，容易接种 细胞浓度高，可降低血
操作
清用量，可以采用高的
搅拌速度和通气量
细胞浓度低，细胞容易 容易产生营养传递障碍， 受剪切力、搅拌、碰撞 积聚代谢副产物
4、基因工程细胞：将编码药用蛋白质的基因重组到动物细胞构建工程菌
5、转化细胞： 体外可无限传代和生长繁殖，遗传、生长、 生物学特性可能改变 从生产方式上可分为细胞自转化和人工诱发转化
6、常用细胞株： CHO细胞 Vero cell
BHK-21细胞
WⅠ-38细胞
11.7 动物细胞大规模培养
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细胞形态检查
Δ将培养瓶放在倒置显微镜下观察。 Δ状态良好的细胞：轮廓形态不十分清晰，较透明。 Δ生长不良的细胞：轮廓变清晰，细胞间隙
增大，胞内活力分析
采用MTT法。 活细胞的线粒体脱氧氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫 色产物甲暨并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲 亚砜（DMSO）能溶解蓝紫色结晶物，溶液 颜色深浅与所含甲暨量成正比。用酶标仪测 定OD570nm值就可以分析活细胞数量。
易出现微生物污染。 细菌污染时培养液变浑浊，镜检可见。 PPLO因个体小，能透过滤器，污染时培养物无变化，不易发现。 严格遵守无菌操作。
11.6 细胞系与细胞株
细胞系：由原代培养经传代培养纯化，获得 的能在体外生存的细胞群体。 有限细胞系与连续细胞系
细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用 单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细 胞增殖形成的细胞群
2、人工纯化
反复贴壁法 酶消化法
机械法
3、克隆化培养
毛细管法 有限稀释法
细胞保存多采用冻存、低温液氮冻存
11.6.2适合工业化生产的细胞株
1、原代细胞： 需要大量动物组织、成本高、费时费力
2、二倍体细胞： 二倍体染色体，具有贴壁和接触抑制特性，有限的繁殖能 力，无致瘤性
3、融合细胞： 具有两亲本特征
理想的微载体应具备以下几个特征：
➢良好的生物相容性，无毒无害 ➢有好的黏附性，一般带正电荷 ➢大的比表面积，颗粒均匀，孔径均一 ➢良好的传质性能 ➢强的机械性能，长时间搅拌状态下不破碎，能保护细胞，方便
清洗处理，重复利用 ➢好的热稳定性，在121℃蒸汽灭菌条件下不分解、不破碎、不 软化，适合高压灭菌