• 诱导物的采用三种方法：1）在农杆菌液体培养基 时加AS，加入时间在制备工程菌侵染液前4－6小时 加入；2）AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基 中；3）在农杆菌液体培养基中和共培养基中都加 入AS。
• 含AS的培养基PH值为5.0-5.6时，vir区基因的诱导 达最高水平。
外植体的选择
• 通过对不同外植体转化成功的实例分析， 叶片（叶柄）为35％、子叶为9％、胚轴 为10％、茎为17％。
三、根癌农杆菌Ti质粒转化方法
• 整体植株接种共感染法 • 优点：实验周期短；充分利用无菌实生苗
的生长潜力；避免在转化过程中其它细菌 污染；避免农杆菌在培养基上的过度生长； 具较高的转化率。 • 缺点：嵌合体严重；转化细胞的筛选困难。 • 原生质体共培养转化法 • 最大优点实减少嵌合体产生；缺点是原生 质体再生困难，获得转化株少，操作比较 复杂。
移到含抗生素的培养基上培养。 • 脱菌的抗生素：常用的脱菌抗生素有羧苄
青霉素、头孢霉素等；使用原则是在达到 抑制农杆菌生长的目的后，尽量降低其浓 度。 • 脱菌培养时间：脱菌培养的时间一般需5－ 6次继代培养，有的一直使用抗生素，直到
试管苗形成。
• 转化体的选择培养
• 选择压：抗生素加入培养基后，对细胞 的生长产生一种选择作用，即为选择压 。加入的抗生素浓度越大，选择压也越 大。选择压的强度应根据植物的特性而 定，一般浓度范围Km为50－100mg/L； htp为10－20 mg/L ，ppt为5－20 mg/L 。
2）田间取材通过预培养起驯化作用，使外植体 适应于试管离体培养条件，保持活跃的生长代谢状 态；
3）减少外植体转化过程中的杂菌污染率；
• 有利于侵染接种的外植体能与培养基平整接触；
• 外植体的预培养时间和培养效果有明显关系，一般 2－3天为宜。
外植体的农杆菌接种
• 掌握外植体在菌液中浸泡的时间，一般控 制在数秒至数分，以叶盘边缘充分湿润为 度，不要超过30分钟；
• 不同外植体与农杆菌的最佳共培养时间不同。
• 农杆菌的增殖适度 • 共培养中农杆菌的增殖适度直接与转
化有关，农杆菌增殖和生长状态与其 侵染能力相关。 • 控制农杆菌增殖的方法：
1）调整工程菌的浓度； 2）控制共培养时间； 3）使用抗生素调控农杆菌的增殖 生长。
外植体脱菌及选择培养
• 外植体的脱菌培养 所谓脱菌培养，就是把共培养的外植体转
根癌农杆菌的遗传宿主及内共生原理
• 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号 ；
• 这些化学诱导物通过农杆菌的细胞膜，活化virA和 virG基因，再诱导vir区的其他基因；
• vir基因的活化，作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移； • T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上； • T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素； • 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因，分解
• 转化外植体的选择原则： 1）以叶片、子叶、胚轴为首选材料； 2）要注意外植体年龄，选择幼年的外
植体； 3）以幼胚、体细胞胚及成熟胚作为外
植体应考虑其转化的最佳感受期； 4）应考虑感受太细胞在外植体的部位
。
外植体的预培养、接种及共培养
• 外植体的预培养作用：
1）促进细胞分裂，分裂状态的细胞更容易整合 外源DN部分： • 受体系统的建立； • Ti质粒转化载体的构建； • 目的基因的转化。
根癌农杆菌的制备
• 农杆菌的培养、生长状态及纯度对转化具有重要作用 。
• 农杆菌的培养：
1）培养基：目前常用的农杆菌培养基有LB、YEB、 YEM、TY、PA、523等，其中LB、YEB、YEM、523属富 集培养基，是常用的制备工程菌液的培养基；PA和TY 是常用的农杆菌选择培养时的培养基。
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
学生：贾俊忠 学号：2019103070
一.根癌农杆菌的生物学特性 • 农杆菌细胞呈杆状，以1－4根周生鞭毛进行
运动。农杆菌侵染时，细菌通过原有的病斑 或伤口进入宿主组织，但细菌本身不进入宿 主植物细胞，只是把Ti质粒的DNA片段导入 植物细胞的基因组中； • 根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，对单 子叶植物不很敏感。
• 在选择培养条件下再生细胞和转化细胞是 否一致，关系到能否得到真正的转会体， 只有同时具有再生和转化潜力的细胞才有 可能分化成转基因植株。
• 假转化体产生的原因：1）外植体的再生部 位与选择培养基未充分接触，选择压不起 作用；2）转化细胞对非转化细胞的滋养作 用；3）转移T-DNA未整合，只是瞬时表达 ；4）生理性抗性植株。
• 选择的方法及时期
• 根据选择和再生的关系分两种：一种 是先再生后选择，弊端是嵌合体严重， 假转化体多，后期选择纯化困难；另 一种是先选择后再生，转化体少，但 嵌合体少，假转化体少，转化体纯化 方便。
•
根据选择压加入的时期不同，分为前 期选择、延迟选择和后期选择。
• 选择培养过程中转化和再生细胞的一致性
植物细胞产生的冠瘿碱作为唯一的碳源和氮源； • 冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti
质粒的接合转移，扩大侵染范围。
• 根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因 导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源 基因在植物细胞中得到表达，致使植物细胞 转化为肿瘤状态，并大量合成冠瘿碱。这些 冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源，有利于农杆 菌的繁殖和Ti质粒的转移，进一步扩大侵染 领域。
2）农杆菌的生长条件：农杆菌培养分为固体平板 培养和液体振荡培养，固体培养一般需2－3天，液体 培养一般需1－2天，25－30度；当细菌增长达对数生 长期，可以稀释培养或储存于4度冰箱；用光密度测
定法测定农杆菌浓度。
Vir区基因活化诱导物的使用
• Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化 合物对vir区基因的活化具有重要作用，常用的诱 导物是乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮；
• 菌液浓度对不同植物的外植体有一定差异 ，一般浓度范围OD600＝0.05-0.7之间；
• 浸泡后的外植体在滤纸上吸干要适度。
农杆菌与外植体的共培养
• 最佳共培养时间：农杆菌附着后不能立即转化， 只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤 ，因此，共培养时间必须长于16h，时间过长，由 于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死 亡。