3.9 糖蛋白中糖的分析
对糖蛋白化学结构分析的意义:
附着于蛋白质的寡糖可以上调、下调或抑制糖蛋白的 生物活性，还可以影响蛋白质的代谢命运、稳定性或 溶解性.
通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达， 可以导致生产不同类型的糖蛋白。即使在相同的细胞 类型中，也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细 结构不同和普通寡糖产生的相对频率不同而产生截然 不同的糖蛋白。
3.4肽图分析 概念: 意义:一级结构 ,工艺稳定性 肽图的裂解方法 : （1）化学裂解法 （2）蛋白酶裂解法 （3）特殊处理: 二硫键、空间构象较复杂的特
殊产品
肽图常用的分析方法有： （1）SDS-PAGE电泳： （2）反相HPLC(RP-HPLC)： （3）毛细管电泳： （4）液质分析：
Intens. x108 1 0 x107 2 0
重组制品原液蛋白量少，纯度高，可用 Lowry法或Bradford法测定蛋白含量。
细胞因子蛋白含量正逐步采用HPLC法， HPLC法测定蛋白含量能够排除溶剂系统的干 扰，特别适用于进行批与批之间的质量控制。
3、蛋白质药物理化性质的鉴定
3.1 特异性鉴别试验 主要确定蛋白质的抗原性 免疫学方法：根据抗原抗体特异反应建立的方法。 重组产品通常用免疫印迹和点免疫进行鉴定，特别
2.1凯氏定氮法
不需要昂贵的仪器设备，操作比较繁琐， 灵敏度较低(毫克水平)，其结果受非蛋白氮的 影响，可用钨酸沉淀法或三氯醋酸沉淀法加以 排除。
2.2 Folin-酚试剂法(Lowry法)
灵敏范围：5～100μg／ml，该方法适合蛋白质 的微量测定。
优点：方法简便，灵敏度较高，较紫外吸收法灵 敏10～20倍，较双缩脲法灵敏100倍左右。所用仪 器简单，不同蛋白质间的变异少，是蛋白质量化的 可靠方法。所需时间：约40min。目前国内外多数 重组制品原液蛋白含量用该法进行测定。
回收，但结果受光吸收物质影响。
适合于含有共轭双键较多的芳香族氨基酸的 蛋白质含量测定。
该测定方法简单、灵敏、快速，在蛋白质和酶的生化制备中 广泛应用，特别是在柱层析分离中，利用280nm进行紫外检测 来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。如重组尿激酶原 (Pro-UK)的质量检测标准中的蛋白含量测定项目就采用此法完 成。
与产品相关的杂质包括：
突变物、错误裂解的产品、二硫化物异构体、 二聚体和多聚体；化学修饰的形态：脱去酰氨 基的或氧化的形态、其他降解产物等。
4.1宿主细胞蛋白含量
概念: 宿主细胞蛋白质一般简称宿主蛋白，是指生产过
程中来自宿主或培养基的残留肽等杂质。基因工程 药物中的宿主蛋白含量，可用 ELISA法(enzymelinked immunosorbent assay)测定。
缺点：
受多种物质干扰，反应速度慢，某些试剂不稳定， 蛋自质不可逆变性，芳香族氨基酸比例会影响蛋白 检测结果。
2.3 BCA法
从Lowry法派生的蛋白含量测定方法。
优点：操作比较简单，采用单一试剂4,4’-二羧酸2,2’-二喹啉(bicichoninic Acid，BCA)，终产物稳定， 比Lowry法的干扰物少；所需时间：2h或过夜。
当电泳出现两条或两条以上区带时则应该用免疫印 迹进行鉴定。 半干胶转移免疫印迹法是最常用的方法。
印迹的效率取决于蛋白质从胶上转移到膜上的效率以 及蛋白质与膜结合的效率。在印迹实验开始时，蛋白 质位于凝胶内部并带有十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS 的负电性使得SDS蛋白复合物移向正极。在移动过程 中，SDS不断地从蛋白质上脱离。当蛋白质到达疏水 膜，一些疏水结合位点不带有SDS时，可以与膜发生 疏水互相作用。蛋白质结合到膜上，SDS不断地从蛋 白质脱离并移向正极而蛋白质则留在了膜上。
糖蛋白的糖基化分析 : 糖基化位点,分子量,糖的组成,连接方式, 分析方法: 酶解,质谱,LC/MS,GC/MS
4、残余杂质检测
残余杂质可分为外来污染物和与产品相关的杂 质两大类。
外来污染物包括：微生物污染、热原、细胞的 成分(例如细胞的蛋白质，DNA其他的组分)、 培养基中的成分、来自生产过程各步骤中的物 质、来自产品纯化步骤中的物质(亲和柱中的 抗体，其他试剂)；
3.7 N末端和C末端氨基酸测序 作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般要 求至少测定N端15个氨基酸。在中试头三批产品 应当测定；C端定1～3个，但在我国现有法规中 C端不一定要测定。
3.8 蛋白质的二硫键分析 二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关。测
定巯基的方法有PMCB法、DTNB法和NEMI法等。对 二硫键的分析虽然在常检定项目中没有规定，但在质 量研究中应尽可能分析清楚。 有些产品二硫键较多，用现有的技术完全分析清楚很 困难，可以结合其他项目的检测，如比活性等进行有 效的质量控制。
如何认识蛋白质类药物纯度检测？
1 从蛋白质制剂中检测出少量的污染蛋白质是 很困难的。因为污染蛋白质的量可能低于很多 测定方法的检测下限。制剂中往往含有大量的 辅料。
2 当用一种方法测定蛋白质纯度时，可能有两 种或更多的蛋白质表现出相似的行为。这种类 似的行为可能会导致本来是混合物的样品也被 认为是均一物质的错误结论。
优点：快速，非破坏性，直接测定不需要标准品，不消耗样 品，低浓度的盐类不干扰测定。
缺点①如果一种蛋白不含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，它将无 法检测；②若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出 现较大干扰。
2.6 ELISA法
为特异蛋白含量测定方法，具有特异性强， 灵敏度高，同时测定样品多等特点，可用于生 产过程中目标蛋白含量的测定。
3.3等电点测定 可以表征药物的理化性质和纯度 均一的重组蛋白质只有一个等电点，有时因加工 修饰等影响可出现多个等电点，但应有一定的范 围。所以等电点测定是控制重组产品生产工艺稳 定性的重要指标。
常用的测定方法: 等电聚焦电泳法(IEF)： 毛细管电泳法(CE)：该法用紫外检测，适用于某些不 易染色的蛋白质多肽，如EGF、hCGRP等制品的测 定。 标准中等电点的规定: 等电点标准应规定为在±0.5pH范围之内，应有明 显的主显带。
5 没有一个真正的检验纯度的方法，只有检 测样品不纯或非均一的方法。
1.1非还原SDS-PAGE电泳法 银染法染色，加样量不低于5μg。 考马斯亮蓝R-250染色，加样量不低于10μg。 结果应无明显杂蛋白出现，经扫描仪扫描，蛋白量 应不低于总蛋白量的95％或98％。
1.2 HPLC法(分子筛层析、反相HPLC、离子交换层析等)
加入样品及PECP对照标准培养，37℃放置2小时．
３加抗体：
经洗涤后，加入抗PECP/HRP结合物(antiPECP/HRP conjugate)[HRP为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase)的简称]使其与固相抗体 结合。
五、蛋白质药物质量控制的要点
1、蛋白质纯度检查 2、蛋白质含量测定 3、蛋白质药物理化性质的鉴定 4、残余杂质检测
1、蛋白质纯度检查
世界卫生组织规定必须用HPLC和非还原SDSPAGE两种方法测定，其纯度都应达到95%以上才 能合格。
某些重组药物的纯度要求更高，要达到99％以 上。
纯度的检测通常是在原液(drug subs-58和Cys-105形成的二硫键， Cys-125是以游离巯基形式存在。
错误配对，生物活性原来的1／400，会引起抗原性增 强。
分析：pH8.5下用3H-碘乙酸处理IL-2，使游离巯基与 3H-碘乙酸作用形成衍生物。然后再还原打开二硫键， 并用14C-碘乙酸处理，结果3H-标记仅在肽-11上 (Cys-125)，而肽-11基本上无14C放射性。相反14C 的放射性全在肽-12和肽-14上(Cys-58与Cys-105的 二硫键位置上)。
2.7 HPLC法 具有定量精确，灵敏度高，重复性好，自动化
程度高等特点。 需要同种蛋白做标准品。
2.8 SDS-PAGE-CBB G250(Coomassie brilliant blue G-250,CBBG ) 染色-比色法
结合Lowry法等总蛋白含量的测定，可用于 复杂的蛋白混合物中目标蛋白的定量测定。
m4A00U 200 x1007
1
0 x107
0 0
SHENG--0.D: TIC ±All MS SHENG--0.D: BPC 50-1800 ±All MS SHENG--0.D: UV Chromatogram, 215 nm
SHENG--0.D: EIC 1045.5 ±All MS SHENG--0.D: EIC 1023.5 ±All MS
2、蛋白质含量测定
在质量标准中设定此项目主要用于原液比活性计 算和成品(drug product)规格的控制。
蛋白含量采用Folin-酚试剂法(Lowry法)、染色 法(Bradford法)、双缩脲法、紫外吸收法、HPLC法 和凯氏定氮等方法。
其中Lowry法和Bradford法是在质量检定中经常 使用的方法。
10
20
30
40
50
60
Time [min]
3.5 吸收光谱 某一重组蛋白质来说，其最大吸收波长是固定的； 在生产过程中每批产品的紫外吸收光谱应当是一致的。 有的重组产品一级结构不含芳香族氨基酸，在280nm 附近没有最大吸收峰，可不做紫外吸收光谱测定， 如重组脑利钠肽(rhBNP)。
3.6 氨基酸组成分析 是结构分析的辅助手段,质量控制的重要指标. 在生产的控制中,样品的氨基酸组成结果应与标 准品一致。 这在试生产的头三批或工艺改变时应当测定。
缺点：反应时间长，蛋白质不可逆变性。灵敏范围： 标准分析：10～1200μg／mi；微量分析： 0.5~10μg／ml。
2.4 Bradford法
Bradford法是采用考马斯亮蓝G-250与蛋白 质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的 方法。需要时间；10min。灵敏范围：25～ 200μg／ml；0.1ml的最小体积可测得的最低蛋 白为2.5μg。