植物抗寒性鉴定我国植物种类繁多，分布区域广，在晚秋和早春时期发生的冻害和冷害两种低温危害，常常给越冬作物和果木造成严重伤害。

冻害由0℃以下低温造成，冷害由0℃以上低温引起，冷害对植物的伤害程度，除取决于低温外，还取决于低温维持时间的长短。

植物抗寒性的强弱决定其生长季节，因此蔬菜作物利用抗寒品种，可以将露地栽培提前，提早供应市场；而选育抗寒性强的果树品种，不仅是寒带果树育种者的主攻方向，而且也是温带甚至热带果树育种者重要育种目标之一。

本实验重点学习实验室间接鉴定果树抗寒性的方法和步骤。

一、试材及用具1．试材及处理：植物枝条或花朵，将采回的枝条剪成40cm左右的长度，用自来水冲洗数遍（洗掉泥土、灰尘、虫卵），再用蒸馏水冲洗三次，然后用吸水纸吸干水分，最后将枝条末端进行蜡封。

将每个品种蜡封后的枝条分成相等的6份，其中一份作为对照，其余每份作为一个低温处理，放于冰箱中（0℃～4℃）保存备用。

每次处理时，各取参试品种的一份枝条放于超低温冰箱或程控冰箱内进行低温处理，处理温度梯度为：CK（0℃），-20℃，-25℃，-30℃，-35℃，-40℃。

降温速度为4℃/h，达到目的处理温度后维持12h，然后逐步升温，升温速度亦为4℃/h。

花朵的处理温度梯度为：CK（0℃），-1℃，-3℃，-5℃，-6℃，-7℃，-8℃。

2．仪器烘箱，发芽箱，培养皿，标牌，电导仪，具塞刻度试管（20ml），恒温水浴锅，温度计，玻璃棒，天平，研钵，石英砂，高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（4000lx），容量瓶（250ml、25ml），聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳槽，刻度吸管（10ml、5ml），离心管等。

二、内容说明植物的抗寒性鉴定可分为田间鉴定和实验室间接鉴定两种方法。

1．田间鉴定田间自然鉴定就是在冻害发生期（早春及晚秋）对受冻的田间植株一定器官、组织以一定的标准进行评价、比较，然后根据冻害情况评价抗寒性。

陈学森等（2001）对山东省春季“倒春寒”发生后，受害的核果类果树的花器官的抗寒性进行了调查，选出了当地花期抗寒性较强的红荷包、红丰等杏品种，证明种间的抗寒力大小顺序是：桃﹥杏﹥李﹥大樱桃。

赵玉田（1993）对不同生态型玉米的抗寒性进行了田间鉴定，测定的项目包括３个抗冷指标：相对出苗率（%）（RER）：幼苗干物重（SDW），取地上部三叶期10株幼苗，烘至恒重。

三个抗冷特性以总指数值（TIV）表示，即占各自等级顺序之和。

其值反应了低温下种子出苗生长和干物质积累能力。

田间鉴定能最直接的反映不同品种在同一条件下的抗寒性差异。

该法直接、简单，可进行大范围、大群体的评价，但受地域、品种数量的限制，只能比较少数几个同一地段的品种之间的抗寒力差异，不能对他们的抗寒能力进行量化。

2．实验室间接鉴定实验室间接鉴定，就是根据作物某些生理生化指标及物理指标间接推断供试材料的抗寒性。

物理指标Lyons和Raison（1970）证明植物低温发生时，生物膜首先发生膜脂的物相变化，膜的外形和厚度发生变化，膜上产生龟裂，因而膜的透性增大，电解质大量外渗。

抗寒性强的品种细胞膜透性增大程度轻，抗寒性差的品种与之相反。

因此，测量电解质外渗量变化可以比较植物的抗寒性。

在黑穗醋栗、梨、猕猴桃（Shaoli Lu，1990）等许多种果树的不同器官，如花、枝、叶等都有相似结论。

另外，通过电导率值配以Logistic方程，可以求出半致死温度，确定植物的临界致死温度。

常用差示温度分析来测量深过冷。

以DTA法测定，一般植物在零下几度即散热结冰，称为高温散热。

经过低温锻炼的抗寒木本植物，在连续降温过程中，可见到有多次散热，第一次在零下几度，主要是细胞外结冰，最后一次散热可达-20～-45℃的低温以下，叫低温散热。

在低温散热前一霎那的温度，即深过冷温度，用LTE温度表示。

深过冷低温散热时，可出现细胞内结冰而使组织死亡。

日本京都大学S.K.Kang（1998）等对苹果、桃、梨、柿子和葡萄5种落叶果树通过温度分析测定了两种散热HTE和LTE，发现柿子与葡萄仅有LTE，所有树种的低温散热温度与花芽的半致死温度一致。

生理生化指标主要包括超氧物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖含量等方法。

三、方法步骤（一）质膜透性测定－电导法近年来的研究表明，在低温伤害尤其冷害中，膜系统常常是最先受到伤害的部位，寒害能使脂膜受损伤，透性加大，细胞内离子（主要是K＋离子）外渗量增多，电导率加大。

因此可以用电导仪测定溶液的电导率，求算电解质渗出率（或称伤害率）。

伤害率愈高则愈不抗寒，反之则愈抗寒。

1．电解质渗出率的测定取处理和对照样品各0.5g，放入试管中，加10ml去离子水，置25℃下10h。

用玻璃棒搅拌均匀，然后用电导仪测电导值分别为T1和C1。

再将试管放入沸水中10min，待其冷却至25℃时，测得处理和对照得电导值为T2和C2，按下式计算电解质渗出率和伤害度：2．绝对电解质渗出量的测定有时为了求得电解质的绝对渗出量，需要用分析纯的KCl配成不同浓度的标准液（0.01－10mmol/L），在25℃下测定其电导率值，并绘制电导率（μS/cm）—浓度（mg/ml）标准曲线。

由标准曲线查知样品的外渗电导率值相当于KCl的浓度，再折算每克材料的绝对外渗量（mg/g），即绝对电解质渗出量（mg/g），即绝对电解质渗出量（mg/g）＝A×B/W式中，A—根据样品电导率值，从标准曲线中查出的与KCl相当浓度（mg/ml）；B—浸泡液的体积（ml）；W—样品鲜重（g）。

2．注意事项（1）在电导测定中一般应用去离子水，若制备困难可用普通蒸馏水代替，但在测定中设一空白试管，测定样品时要同时测定其空白电导值，按下式计算相对电导度：（2）CO2在水中的溶解度较高，在测定电导时要防止高CO2气源和口中呼出的CO2进入试管，以免影响结果的稳定性。

（3）温度对溶液电导影响很大，故S1与S2必须在相同温度下测定。

（二）超氧物歧化酶（SOD）测定超氧物歧化酶（SOD）是一种清除超氧阴离子自由基的酶，普遍存在于植物体内。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲月朁，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除超氧阴离子自由基从而抑制了甲月朁的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

1．试剂配制0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。

750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存。

100μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。

20μmol/L核黄素溶液：称取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存。

2．酶液提取称取处理和对照样品各0.5g，加入5ml磷酸缓冲液，冰浴研磨提取，然后15000rpm离心10min，所提上清液为酶液。

3．显色反应3ml反应液为0.05mol/L磷酸缓冲液1.5ml，750umol.L-1NBT溶液、130mmol/L 甲硫氨酸（MET）溶液、100umol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）液、20umol/L 核黄素各0.3ml，蒸馏水0.25ml和0.05ml酶提取液（对照管加蒸馏水）。

混匀后将１支对照管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时间延长）。

4．SOD活性测定与计算反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的光吸收，已知SOD 活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。

式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；ACK—照光对照管的光吸收值；AE—样品管的光吸收值；V—样液总体积（cm3）；Vt—测定时样品用量（cm3）；W－样重（g）；蛋白质浓度单位为：mg蛋白/g样重。

研究表明，当遭受低温胁迫时，引起SOD活性的下降，下降的百分率与品种抗冷性呈负相关，故能反应品种间抗冷能力的高低。

（三）过氧化氢酶（CAT）活性的测定低温胁迫下，细胞内易产生H2O2破坏膜系统的稳定，而过氧化氢酶（CAT）能把H2O2分解为H2O和O2，从而清除H2O2维护膜的稳定性。

研究表明，抗寒性强的品种有较高的过氧化氢酶活性，且随温度下降，以抗寒性强的品种下降幅度小，与抗寒性呈显著性相关。

CAT酶活性大小可用一定时间内分解的H2O2量来表示。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2，即可求出被CAT分解的H2O2量：1．试剂配制10%H2SO4；0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH＝7.8）；0.1mol/L 高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.160g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸标定；0.1mol/L H2O2：取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液在酸性条件下标定。

2．酶液提取取剪碎的样品2.5g加入磷酸缓冲液（pH7.8）少量，研磨成匀浆，转移到25ml 容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000×g 离心10min，上清液为酶粗提液。

3．酶液滴定取50ml三角瓶4个（两个测定，两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液2.5ml；再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计算时间，于30℃恒温水浴中反应10min，立即加入10%H2SO4 2.5ml。

然后用0.1mol/L KMnO4滴定，至出现粉红色（30min内不消失）为终点。

4．结果计算酶活性用每克鲜重样品在10min内分解H2O2毫克数表示。

A－对照KMnO4滴定ml数；B－酶反应后KMnO4滴定ml数；V－酶提取液总量（ml）；a－反应所用酶液量（ml）；W－样重（g）。

5．注意事项所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要经过标定，0.1mol/L H2O2要新配制。

（四）过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析1．过氧化物酶（POD）活性测定在过氧化物酶催化下，过氧化氢分解成水和原子氧，原子氧能氧化联苯胺产生一种蓝色的化学物质，该蓝色化合物在波长580nm处有一最大吸收峰。