免疫学技术主要相关内容
免疫细胞相关实验技术：单核巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、T细胞、B细胞， 以及这些细胞亚群； 免疫分子相关实验技术：抗原（包括抗原肽）、抗体（包括单抗、多抗、基因工
程抗体）、补体、细胞因子及其受体、HLA、TLR等；
免疫学相关标记技术：荧光、酶、放射、磁珠标记技术和发光分析原理； 免疫学相关蛋白质技术：蛋白质电泳、印迹技术（如 SDS-PAGE、双向电泳、 Western 印迹和斑点印迹）、免疫共沉淀技术等； 免疫学相关检测技术：流式细胞分析和分选技术、细胞凋亡和细胞周期检测技术 、免疫组织化学技术、免疫细胞信号转导研究技术、激光扫描共聚焦显微镜技术 等； 免疫学实验相关动物模型：自身免疫病动物模型（如自身免疫性脑脊髓炎、自身 免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮等）、感染性疾病动物模型（如利什曼原虫、 弓形虫、巨细胞病毒、李斯特菌等）、肿瘤动物模型、器官移植动物模型等；
免疫共沉淀
（Co-Immunoprecipitation）
原
理
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原
之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典
方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有 效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整 细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下 来。如果用蛋白质a的抗体免疫沉淀a，那么与a在体内结合 的蛋白质b也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白 质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作
成的防御功能，乃经遗传而获得
，并非针对特定抗原。
适应性免疫（adaptive immunity）
机体接受病原体等抗原（决定基）异物刺激后所产生、仅针对相应病原体等抗原 异物发挥效应、使之从体内被清除的防御功能。 * 个体接触特定抗原（决定基）而产生。 * 仅针对该特定抗原（决定基）而发生反应。 * 后天获得；有特异性；有记忆性；作用慢而强。
抗原抗体比例影响免疫复合物的大小 抗原抗体反应的两个阶段
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抗原抗体反应的影响因素

抗原抗体浓度与比例 电解质
* 抗原抗体特异性结合后，亲水性降低，易受电解 质的影响而使表面失去较多的负电荷。

温度
* 适当的温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会， 加速抗原抗体复合物的形成。

酸碱度
* 抗原抗体反应的最适pH在6—8之间，pH过高或过 低，即过碱或过酸，均可影响抗原、抗体的理化 性质。
二、沉淀反应

免疫沉淀反应: (precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下发生结合，
出现的沉淀现象。
液体内沉淀反应 絮状沉淀试验 环状沉淀试验 单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫固定电泳 透射免疫比浊 turbidimetermeasure 散射免疫比浊 nephelomitermeasure
将可溶性抗原或抗体吸附在与免疫无关的颗 粒载体上，形成致敏颗粒，再与相应抗体或抗原 进行反应产生的凝集反应，称为间接凝集反应。 颗粒载体有红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒、活 性炭颗粒，而相应的凝集现象分别称为间接血球 凝集、间接乳胶凝集、间接炭粒凝集反应。
微粒捕获酶免疫分析技术
将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素 —亲和素—酶放大系统相结合，最后酶作用于荧 光底物，使之发荧光，通过检测荧光强度判断待 测抗原的含量。 检测肿瘤标记物CAl99、CEA、CAl25、AFP、 性激素、甲状腺素T3T4、叶酸、HIV抗体、HCG等 微量可溶性抗原。
免疫学技术在科研 中的应用
概 述
免疫学技术发展进程的主要阶段
自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应 ） 加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术 ）
标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性
半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了 反应过程 标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合
性及定量检测的方法。其鉴定蛋白质的敏感性为1—5ng。
WB是进行蛋白质分析时最常用技术之一。
检测可溶性抗原、细胞成分的鉴定与分析，检测与自 身变性细胞核成分结合的抗体(抗核抗体)，HIV的明确诊断
。
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WB电泳、转膜装置
流 程 图
常见问题及解决方案
注意事项:
1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关. 因此, 凝胶 电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太 低, 如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一 次梯度稀释, 上样电泳后, 直接考马斯亮蓝染色选择 最佳上样量.
Overview of Immunity 免疫的类型
固有免疫 适应性免疫
innate immunity
adaptive immunity
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固有免疫
病原微生物
innate immunity
固有（innate)/天然(natural) 非特异性（non-specific)免疫 （immunity） * 种群在长期进化过程中逐渐形
可刺激机体产生特异性免疫 应答的物质
产生抗体 刺激机体 致敏淋巴 细胞
抗原决定簇
抗原
适应性免疫
固有免疫与适应性免疫的特点
————————————————————————————— 固有免疫 适应性免疫 ————————————————————————————— 细胞组成 粘膜和上皮细胞、 T淋巴细胞、B淋巴细胞、 吞噬细胞、 NK细胞、 抗原提呈细胞 NK1.1+T细胞、γ δ T细胞 B-1细胞 产生 先天具有 后天经抗原刺激而获得
对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis ）
原 理
是将双向扩散与 电泳技术相结合的一 种方法。将抗原和抗 体在琼脂凝胶孔中电 泳，带负电荷的抗原 向正极运动，带正电 荷的抗体向负极运动 ，二者在琼脂凝胶中 相互作用而形成沉淀 线。
免疫印迹技术
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB ）是将蛋白 样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂 交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性定
5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减 少蛋白质带的拖尾现象
6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓 冲液
7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月,但是反 复冻融会使蛋白质降解. 8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电 泳结束后也应尽快转印. 9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔 . 10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一 角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对PDVF 膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系. 11. 转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝 胶对应负极, PDVF膜对应正极.
用搭档。
Co-IP工作示意图
b
a
Y
ab
Y
ba
b
binding wash
a
elution
利用western blot 确定捕获蛋白
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实 验 步 骤
收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30min, 细胞裂解液于40C 10,000 rpm 离心10 min后取上清； 取少量裂解液以备 western blot分析，剩余裂解液加1μ g相应的抗 体加入到细胞裂解液，40C缓慢摇晃孵育过夜； 取10μ l protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3,000 rpm 离心3 min； 将预处理过的10μ l protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细 胞裂解液中40C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连 ；
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常用的抗原抗体反应
凝集反应 沉淀反应
免疫标记技术
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一、凝集反应
细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解
质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反
应（agglutination）是最经典的免疫学检测技术。
直接凝集反应 间接凝集反应 间接凝集抑制试验
微粒捕获酶免疫分析技术
间接凝集反应
火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis）
原 理
是将单向扩散与电泳 技术相结合的一种方法。 将含有已知抗体的琼脂制 成琼脂板。待检样品加入 阴极侧进行电泳。抗原带 负电荷向阳极移动，并与 抗体结合。在抗原、抗体 比例适当部位形成锥形沉 淀峰，该峰的高度与抗原 量成正比。可快速测出标 本中抗原的含量。
2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度, 激活剂的浓度适 当,不仅可以决定凝胶聚合的速度, 也将影响凝胶的质 量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度. 因此,建议 要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶 从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分 钟最佳, 对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见 聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合.
原 理
将一定量的抗 体混入琼脂凝胶中 ，使待测抗原在凝 胶中自由扩散，与 相应抗体结合形成 沉淀环，沉淀环大 小与抗原浓度呈正 相关。
1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度
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双向琼脂扩散实验（ double immunodiffusion ）
原 理
将可溶性抗 原和抗体置于琼 脂凝胶板的对应 孔中，两者各自 在凝胶中向四周 自由扩散，当抗 原与抗体相遇， 在比例合适时形 成沉淀线。
Part III 自身免疫病及实验研究举例
PartI 抗原或抗体的检测
抗原抗体反应的特点
抗原抗体反应的影响因素 常用的抗原抗体反应
抗原抗体反应的特点
高外，主要以氢键、静 电引力、范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之 间的非共价方式结合。这种非共价键不如共价键结合 稳定，极易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离 。