叠氮化物
固定化酶 －CH2CO-NH 酶
羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序
d.烷化法
• 一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联 酶,与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化 酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。
优缺点
优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长
时间使用。
缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏
（2）所用载体
重氮化法：具有氨基的不溶性载体（R－NH2）。 以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。 多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃 烷 化 法：卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤 维素、碘乙酰纤维素） 含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）
（3）方法
载体的活化：通过一定的方法，在载体上引进一个活泼基团
包埋法制备固定化菌体应用举例
包埋材料 琼脂
菌种 大肠杆菌 大肠杆菌
酶系
用途
明胶－戊二醛 短乳杆菌 链霉菌 聚丙烯酰胺 大肠杆菌
醋酸纤维素 大肠杆菌
谷氨酸脱羧酶 制造γ-酪蛋白 青霉素酰胺酶 生产6-氨基青霉烷酸 (6-APA) 葡萄糖异构酶 从葡萄糖生产高果糖 浆
天门冬氨酸酶 青霉素酰胺酶 生产6－APA （裂解） 青霉素酰胺酶 生产半合成青霉素 （合成）
c.叠氮法
• 在酶分子与载体间形成肽键的固定化方法。主要 是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸 盐等活化形态的衍生物，然后与酶的游离氨基反 应，从而形成肽键。
纤维素
CMC －CH2COOH
+盐酸甲醇
CMC－甲酯 ＋肼 制备酰肼 CMC－酰肼 亚硫酸钠 ＋ 盐酸 CMC－叠氮化物 ＋NH2 酶
第四节 固定化酶催化反应动力学
• 固定化对酶活性及酶反应系统的影响 • 酶固定化后的性质变化
• 固定化酶反应动力学
评价固定化酶的指标
• 相对活力＝固定化酶活力/相同蛋白量的游离酶活力＊ 100% • 酶结合效率＝（加入的总酶活力－未结合的酶活力）/加 入的总酶活力＊100% • 酶活力回收率＝固定化酶总活力/加入的总酶活力＊ 100% • 当固定化方法对酶活力没有明显影响时，酶结合效率与酶 活力回收率近似。
(1)保持菌体的完整，防止菌体自溶。 (2)防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时需抑制胞内其 他酶的活性防止副产物的形成。 (3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。
2. 缺点：
一 包埋法
1 原理
将细胞包进多孔载体内，小分子的底物和产物均可 自由出入，而细胞却不会漏出。。
2 方法
常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂
特点
• 反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较 低。尽可能地降低交联剂的浓度和缩短反应时间 有利于固定化酶比活性的提高。 • 缺点： 固定化后，往往颗粒小，机械性能差。
克服的方法
• 酶先吸附在载体上，或者包埋在胶内，微囊内， 再交联或者固定成酶膜，或者酶网颗粒
3 包埋法制备固定化酶
酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在 凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。
构象改变、立体屏蔽
2.分配效应
• 分配效应是固定化载体亲水、疏水性质对底物、产物在微 环境和宏观体系之间发生的不等分配，从而改变酶反应系 统组成的平衡而最终影响酶反应速度的一种效应。
⑴ 载体与底物带相同电荷，Km’>Km 固定化酶降 低了酶的亲和力。 ⑵ 载体与底物电荷相反，静电作用，Km’<Km • 上面的效应可以通过调节离子强度减弱而消除
强
交联法
包埋法
难 中 易变 强
难 高
底物特异性
结合能力
不变
中
不变
弱
再生
可能
可能
不可
不可
不可
第二节 辅酶的固定化
1. • • • • 辅基的固定化 对于必需辅基的酶，固定化酶时一般将辅基同时固定。 一般辅基分子和载体之间要接入0.5～1.0nm长的间隔基。 将辅基共价结合于载体上之前，要考虑在辅基分子的适 当位置引入功能团，如引入羧基或氨基，使之易与载体 偶联。 磷酸吡哆醛，FAD、FMN、TPP、生物素、硫辛酸、卟 啉等可利用分子本身所具有的功能团。 将具有功能团的辅基先与间隔基结合，再与活化的载体 偶联；或先使间隔基与活化载体结合，再与辅基偶联。
引聚剂：
过硫酸铵、核黄素
（3）制备的固定化酶
凝胶或膜 聚丙烯酰胺凝胶
淀粉 琼脂
酶 α、β－淀粉酶 葡萄糖氧化酶 乳酸脱氢酶 胆碱酯酶 青霉素酰胺酶
2 微型胶囊法 （1）原理 把酶包在超薄半透性 的聚合物膜中，制成 球状含酶微型胶囊。
（2）特点
微囊直径几微米～几百微米。 低分子底物可以自由通过并进入微囊内。 与酶反应后的生成物被排除在微囊外， 酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中， 外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内
a. 重氮法
a.将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处 理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件 下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。
b.溴化氰法
• 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下， 与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可 与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。 • 此方法固定化后相对酶活力比较高，且相当稳定，同时操作 也简便。是最受欢迎的一种方法.
2 共价交联法
双功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使
酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶.
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
发生作用的氨基酸残基
：
酪氨酸的酚基 胱氨酸的SH巯基 N－末端的a－氨基。
常用的双功能或多功能试剂：
戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺
(3)采用疏水载体时，底物是极性物质，Km固定化 后会升高。采用疏水载体时，底物是疏水物质， Km固定化后会降低。
3扩散效应
• 外扩散：底物从液相主体向固定化酶的外表面扩 散，或产物从固定化酶外表面向液相主体的扩散， 外扩散发生在催化反应之前或之后。
•
2、辅酶的固定化
• 辅酶与酶蛋白的结合是松弛的，在固定时要保证能与两种 酶都能有最恰当的结合。 • 将辅酶固定于一高分子上，然后用微囊法将辅酶和两种酶 一同包埋于微囊内。 • 高分子化一般的顺序是先在辅酶的一定部位引入适当的功 能基团或间隔基，生成辅酶的衍生物，然后再与水溶性高 分子共价结合。
第三节 细胞固定化
例子
• 氨基酰化酶20mL固定化，反应后滤液及洗涤液 共50mL。若原酶活力1000u/mL，洗涤液活力 20u/mL。0.5g固定化酶活力为100u（共得50g 固定化酶）。问固定化酶的相对活力是多少？回 收率及结合率是多少？
一、 固定化对酶活性及酶反应的影响
1.构象改变、立体屏蔽
• 构象改变:固定化过程中酶和载体的相互作用引起了酶的 活性中心或调节中心的构象发生了改变，从而导致酶活性 下降的一种效应。多出现于吸附法和共价结合法。 • 立体屏障：载体的孔隙太小，或固定化的方式与位置不当， 给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与 效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。出现 于包埋、吸附和共价结合法。
共价结合
• 通过共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基 酸功能基团连接在不溶于水的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羧基：肽链C－末端的α –羧基，天冬氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
一、什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
化学偶联
固定化酶的源流
固定化酶是1971年在美国举行的第一次世界酶会议 上推荐确定的。又称水不溶性酶、固相酶。 50年代开始。将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与羧 肽酸、淀粉酶等结合制成最早的固定 化酶 1969年。 用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基。 第一个工业生产的固定化酶。
包埋方法有两种： •格子型固定化酶
•微型胶囊法
•格子型固定化酶
（1）原理
以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存 在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的 网状格子中。反应为厌氧反应。
（2）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）
丙烯酰 胺
固定化 酶
光照 切 割 聚合反应 凝胶酶块
酶液
N，N－ 双丙烯 酰胺
二 载体结合法（吸附、离子结合法）
1 原理
将细胞在适当的条件下与载体吸附或形成络合物 固定在载体上。
2 常用载体
硅藻土、多孔玻璃、离子交换纤维素、离子树脂 、DEAE－纤维素。
3 优缺点
优点：方法简单、载
载体 菌体 酶 用途 离子交换纤维 丝状菌孢子 转化酶 蔗糖的转化 素 阴离子树脂 放线菌 葡萄糖异构 制造果糖 酶 DEAE-纤维素 巨大芽孢杆 青霉素酰胺 制造6APA 菌 酶
固定化酶的特点：
• 优点： 1. 不溶于水，易于与产物分离； 2. 可反复使用； 3. 可连续化生产； 4. 稳定性好。 • 缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活， 增加酶的成本
固定化酶的作用模型
以羧甲基纤维素固定 葡萄糖淀粉酶水解淀 粉生产葡萄糖为例说 明。
（1）作用模型
可以连续进行催化 反应（适宜的底物 浓度、温度、pH值 ）
纤维素 麸素 硅胶
离子结合
• 通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固 定化方法。 • 吸附剂 离子交换纤维素，离子交换葡聚糖，离子交换树 脂等。