非洲猪瘟实验室诊断
African Swine Fever, ASF
国家外来动物疫病研究中心 中国动物卫生与流行病学中心
定义
非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传 染性极强的出血性疾病。所有年龄的猪都易感。
——世界动物卫生组织
• 可表现为最急性、急性、亚急性和慢性四 种形式
• 严重程度与毒株、猪种及流行时间的长短 有关
2017/5/15
分子生物学检测方法
O20u17r/a5,1/C5. A., L. Edwards, and C. A. Batten. 2013. Virological diagnosis of African swine fever--comparative study of available tests. Virus research 173:150-158.
感染
表现出临床症状
携带者
Virus
Ab
病毒血症: 感染后2-3天到8天，持续很长时间（数月） 特异性抗体: 从感染后的7-11天至数月，甚至数年 排毒:从 感染早期（第2天）以后持续很长时间。甚至康复后。
实验室诊断
病原学
病毒分离— 血细胞吸附试验 直接免疫荧光法
（FAT） 普通PCR和荧光定量
PCR
• 软蜱是自然界中的贮主并且可以作为传播 媒介
• 法典中将非洲猪瘟的潜伏期定为15天。
2017/5/15
重要性
• OIE动物卫生法典要求必须报告的动物疫病 • 我国动物疫病名录一类动物疫病 • 我国《中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》
明确重点防范的外来动物疫病
病原
– 非洲猪瘟病毒科中唯一成员
临床诊断
各种毒力的毒株均可导致流产
• 胎儿可能全身水肿 • 胎盘、皮肤、心肌或肝脏可能有淤血点
➢病理诊断
诊断
脾脏
肿大 易碎
暗红色至黑色
胃、肝、肾各部位淋巴结肿 大、出血；
水肿
➢肺、肝、膀胱 ➢胆囊充盈 ➢结肠系膜
出血
➢瘀点 ➢瘀斑
肾皮质出血点、出血斑
肺部局部肉芽肿，形成结节
慢性型
肺局部肉变，实变
• 扔掉收集管，重复冲洗步骤（500 µl冲洗缓冲液加入过滤管 ，以8000 g进行1分钟离心操作）。
• 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。以13,000 g进 行10s离心操作以去除残余的冲洗缓冲液。
• 扔掉收集管，将过滤管放入干净的1.5 ml微离心管中。
提取病毒DNA （3）
• 将50 µl—100 µl预热的消毒蒸馏水加入过滤管（ 注意不要使用试剂盒中Elution buffer），以8000 g 进行1分钟离心操作。
➢ 可疑样品：当样品的Ct值大于35小于37并且扩增曲线 呈指数时被判定为可疑，当扩增曲线呈线性时判为阴 性。可疑样品应当重新提取病毒核酸检测，如仍为可 疑，可判为阳性。
实时荧光RPA
• 重组酶聚合酶扩增技术 • 等温扩增（37~42°C） • 用时短：20分钟 • 灵敏度高 • 操作简单，便携式仪器
• 将过滤管以8000 g离心1分钟。如果样本依然留在过滤管中， 重复离心操作。
• 扔掉收集管，将过滤管加入干净的收集管中。
• 将500 µl除抑制物缓冲液（黑盖）放入过滤管，以8000 g离心 1分钟。
• 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。
• 将500 µl冲洗缓冲液（蓝盖）加入过滤管，以8000 g进行1分 钟离心操作。
荧光PCR检测病毒DNA
荧光PCR工作单
样品的可追溯性！
2017/5/15
荧光PCR检测病毒DNA-试剂准备
➢病毒DNA提取试剂盒
➢非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒
荧光PCR检测病毒DNA-试剂制备
➢冻干蛋白酶K: 将蛋白酶K溶解在4.5 ml灭菌后的
蒸馏水中，将溶液以500 µl分装，在 <- 10ºC温度下 储存，直到使用。
• 抗凝血 • 淋巴结 • 脾脏 • 肾脏 • 骨髓
实验室诊断的安全原则
• 保障人员的安全
– 穿戴：眼罩、手套、实验服、口罩和鞋套等 – 行为：洗手、禁止聊天，实验室内禁止食用食
物和饮料等 – 了解化学试剂的特性和潜在的危险
• 保障样品的安全
– 防止样品交叉污染 – 一次性手套
2017/5/15
良好的工作区域
建立了猪瘟、非洲猪瘟的荧光定量PCR鉴别诊断方法
257bp
278bp
英国Pirbright 实验室比对实验
双抗体夹心ELISA检测抗原
阻断ELISA检测抗体
间接ELISA检测抗体
间接ELISA检测病毒抗原
商品化试剂盒INGEZIM K3 (Ingenasa, Spain)
– 价格比PCR便宜 – 不需要复杂的操作 – 适用于基层实验室 – 敏感性低（慢性或亚急性）
• 将DNA溶液在<-10ºC温度下储存（有效期：12个 月），备用；如果DNA溶液在1-2小时内用于PCR 操作，在4 ± 3 ºC 温度下短暂储存，然后冻存。
荧光PCR检测病毒DNA—OIE方法
配制反应体系： ➢ 反应液溶解后，每个反应管中加入18 µl反应液，
然后再加入2 µl模板； ➢ 每次试验需设立反应阳性对照（R+，绿管中的反
– 基于半纯化病毒抗原
2. 商业化ELISA试剂盒
– INGEZIM PPA COMPAC K3 (INGENASA)使用 VP73特异性单抗的阻断ELISA
– SVANOVIR 间接ELISA（重组抗原p30蛋白） – ID Screen 间接ELISA（包被p32、p62和p72蛋白）
荧光PCR检测病毒DNA-样本处理
➢组织样本
取100 mg组织剪碎，加入1 ml PBS研磨或匀浆，然后1050 g或2000 rpm离心10分钟取上清
➢全血（抗凝血）或血清
直接吸取200 µ l
提取病毒DNA
• 将200 µl结合缓冲液（绿盖）和40 µl蛋白酶K（20 mg/mL）加入到1.5 ml离心管中。
– Asfarviridae Asfivirus ASFV
– 兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性 – 唯一核酸为DNA的虫媒病毒 – 只有一个血清型
病原
➢ 特点之一：基因组大
蓝耳病病毒 15kb 12 倍
170~190kb
猪瘟病毒 12kb 15 倍
Genome CSFV
口蹄疫病毒 8kb 24 倍
Genome FMDV
杂 ➢欧洲- I型意大利撒丁岛，II型东欧和俄罗斯
2017/5/15
2017/5/15
血清学检测方法
➢没有疫苗！
抗体=感染
➢没有中和抗体。
➢感染早期既可以检测出抗体（712dpi）
➢抗体持续很长时间
2017/5/15
血清学检测方法
筛选（Screening by ELISA tests） 1. OIE-ELISA 间接ELISA
• 加入200 µl样本。每个提取程序都加入E+ 和 E(200 µl水)对照。
• 立即混匀并在72±2ºC 温度下孵育10分钟。 • 将1.5 ml微离心管简单离心操作，除去管盖内部的
水珠。 • 将100 µl异丙醇加入样本试管，混匀。 • 将过滤管放入收集管中，并将样本移入过滤管。
提取病毒DNA （2）
• 急性型以高热、食欲废绝、皮肤发绀、网 状内皮系统出血为特征，发病后2-10天内 死亡，病死率可高达100%
• 临床上，与古典猪瘟非常相似，难以区分 • 目前没有疫苗！！！
2017/5/15
• 只感染猪 • 家猪和欧亚野猪非常易感
– 感染后存活的猪可能变为无症状的携带者
• 非洲的野生宿主能持续感染很长时间并且 没有临床症状
2017/5/15
实时荧光RPA检测ASFV
• 特异性强
– 与其他病毒无交叉反应
• 敏感性高
– 能检测出不同基因型的毒株
2017/5/15
实时荧光RPA检测ASFV
• 与荧光PCR具有较高的相关性 • 概率回归分析：最低可检测出17个拷贝
2017/5/15
ASFV的基因型
➢22个基因型 ➢非洲22个型：西非I型为主，东非基因型复
临床症状
➢最急性型 ➢急性型 ➢亚急性型 ➢慢性型
2017/5/15
临床诊断
最急性型
• 无临床症状，突然死亡
急性型（强毒株）
• 发烧（41-42°C） • 食欲减退 • 不愿活动 • 局部皮肤变红或变蓝色 • 腹泻 • 呕吐 • 呼吸困难 • 流产 • 死亡率高（10-100%）
仔猪发生ASF，耳、鼻、唇、腿发红，神经症状，数小时内死亡。 Mityana, Uganda, 2010
病原
➢特点之二：基因多变
基因组两端各有一个高变区，基因型多达22个
病原
➢ 特点之三：抵抗力强
温度：
60℃ 20分钟；
56℃ 70分钟
25-37 ℃ 数周
4℃ 冻肉
>1年 数年到数十年
乙醚、氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失活
pH：
4——11.5 无血清 4——13.4 有血清 未熟肉品、腌肉、泔水中可长时间存活
纤维素性心包炎，并可见出血点
图1：ASF 猪尸体底部的发绀病变。图2：耳尖的发绀病变。
图3： 血性腹泻 （血痢）。
图4：急性ASF 死猪肺小叶间的水肿。
图5：胃的基底膜淤血（急性） 图6：典型肿大脆化脾。 （黑浆果脾，急性ASF）
图7：病猪脾（上）与正常脾大小的比较。（急性ASF） 图8：急性ASF 猪肿大的褐色脾。（巴西品种）
➢除抑制物缓冲液: 将20 ml无水乙醇加入原始小瓶