产蛋白酶菌种的分离筛选及发酵一、实验流程二、实验安排1、2班分为2大组，分别进行平行实验。

由各组自行安排实验时间，其中13、14、15三周在指定时间集中实验。

几个重要时间节点为：10周正式进入实验程序；第13周获得目标菌株1株；14周完成种子的摇瓶培养；15周分别完成上罐发酵；16周实验收尾工作。

三、发酵工程实验日程表实验一产蛋白酶微生物菌株的分离【实验材料】1、采样样品食堂泔脚等残存蛋白质丰富的环境周围的土壤或其它蛋白质腐败材料。

2、培养基（1）增殖培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.0～7.2，0.1MPa，灭菌20min。

（2）分离纯化培养基：酪蛋白10 g/L，Na2HPO4 6 g/L，KH2PO4 3 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH4Cl 1 g/L，FeSO4 0.025 g/L，酵母膏0.2 g/L，MgSO4 0.24 g/L，CaCl2 0.011 g/L，溴百里香酚兰0.05 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0～7.2，0.1MPa，灭菌20min。

（3）菌种保存培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3 g/L， NaCl 5g/L，琼脂 20g/L，pH 7.0～7.2，0.1MPa, 灭菌20min。

（4）无菌水：90 mL无菌水/250 mL三角瓶; 9 mL无菌水/试管6支。

3、实验器材刮铲、一次性手套、无菌小塑料袋、试管、三角瓶、培养皿、吸管、接种环和涂布棒等。

4、实验设备涡旋振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、振荡培养箱、恒温培养箱、（数码）显微镜。

【实验步骤】1、采样分别取食堂泔脚池周边土壤，腐烂基质或其它可能含有蛋白酶生产菌的生物制剂10g 装入无菌小塑料袋，在超净工作台上将样品混合均匀从中称取1g作为待增殖的采样样品。

2、增殖培养1g待增殖的采样样品加入50 mL增殖培养基/250 mL三角瓶中，涡旋振荡器上振荡5min ，可设置3组平行。

混匀的液体置于30℃，180 r/min 振荡培养箱中摇瓶培养36 h 。

增殖后的培养液置于80℃水浴中加热10 min 去除营养体细胞，迅速取出冷却至常温，待用。

平行样可以在加热处理后再合并成一个样作为增殖培养液。

3、增殖液梯度稀释在超净工作台中取增殖培养液10 mL 加入装有90 mL 无菌水的250 mL 三角瓶中，静置5 min 后用涡旋振荡器上振荡5 min ，制成10-1稀释菌液。

用无菌吸管吸取1 mL 10-1稀释菌液加入9 mL 无菌水试管中，涡旋振荡器1 min 制成10-2稀释菌液，再依次用无菌吸管吸取1 mL 稀释菌液加入9 mL 无菌水试管中梯度稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍稀释菌液。

4、平板涂布分别取0.1mL 10-6、10-7稀释菌液于分离培养基平板上，用无菌涂布棒分别涂布均匀，每一稀释度重复5个平行。

5、培养将涂布好的平板放入30℃微生物恒温培养箱中倒置培养36 h 后，观察培养结果，统计总菌数、菌落种类及各自比例。

6、菌株鉴别及纯化挑取菌落周围培养基变蓝色的典型菌落，在保存培养基平板上划线纯化至单一菌落。

显微观察菌体形态。

纯化后的纯菌落作斜面菌种保藏作为后续实验的备用菌种。

【实验结果】1、菌落总数MM =)/(101.0ml cfu NnN n =⨯⨯ （1.1）2、目标菌株比例PP=(%)100⨯Mm （1.2）式中：n 为平板上菌落数（个），以出现30-300个菌落的平板计数为宜，0.1为涂布稀释液加量（mL ），10为量取的增殖培养液量（mL ）, m 为变色菌落数，N 为所计数平板的稀释倍数。

3、显微观察典型目标菌落及细胞形态。

实验2 蛋白酶生产菌种的筛选【实验材料】1.待选菌种取“实验1”分离出的待选菌株3~5株，或以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）和地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifornis )等不同产蛋白酶性状的菌株5~7株。

2.培养基（1）鉴别培养基：酪蛋白10 g/L ，Na 2HPO 4 6 g/L ，KH 2PO 4 3 g/L ，NaCl 0.5 g/L ，NH 4Cl 1 g/L ，FeSO 4 0.025 g/L ，酵母膏0.2 g/L ，MgSO 4 0.24 g/L ，CaCl 2 0.011 g/L ，溴百里酚蓝0.05 g/L ，琼脂20 g/L ，pH 7.0～7.2，0.1MPa ，灭菌20min 。

（2）验证培养基：可溶性淀粉10 g/L ，蛋白胨5 g/L ，酵母膏0.25 g/L ， KH 2PO 4 3 g /L ，NaCl 0.5 g /L ，MgSO 4 0.24 g /L ，pH 7.0～7.2，分装成50mL 培养基/250mL 三角瓶，0.1MPa ，灭菌20min 。

3.实验器材游标卡尺、无菌移液管、无菌培养皿、三角瓶、吸管和涂布棒等。

4.实验设备恒温水浴锅、涡旋振荡器、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、振荡培养箱、紫外可见分光光度计、显微镜等。

【实验步骤】1.倒平板将已经灭菌的鉴别培养基自然冷却至50℃左右（即未凝固之前。

可以将装有融化状态培养基的三角瓶放在50℃恒温水浴锅中保持。

注意倒平板时培养温度过高，培养皿盖上易产生较多的冷凝水，影响菌落形成的自然形态），在超净工作台上无菌操作倒平板，培养基凝固后待用。

2.点种接种无菌操作用接种环从待选菌株斜面上取一环菌苔点种在鉴别培养基平板上，每平板上选取分布合适的三个点以点种接种方式接入菌体，在平板培养皿上标记各菌株代号。

不同菌株分别接种在不同平板上，各菌株分别做3组平行试验。

3.培养接种后的平板置于30～32℃下恒温培养箱中培养36 h。

4.变色圈测量分别在培养12h、24 h和36h时用游标卡尺从平板培养皿背面分别测定各菌的变色圈直径（mm）与菌落直径（mm），计算其直径比值。

5.验证性培养选取变色圈直径与菌落直径比值最大的菌株与最小的菌株用接种环分别接入2环菌体于验证液体培养基中，30~32℃，180r/min振荡培养箱中摇瓶培养48 h，将发酵液过滤或离心，取清夜检测其中的蛋白酶产量(U)。

6.蛋白酶活力测定参照附件Ⅸ“蛋白酶活力测定方法”。

【实验结果】1、蛋白酶生产菌种的筛选表1-1 蛋白酶生产菌种的筛选注：平均变色速率为单位时间内菌落周围蓝色变色圈直径增加的程度，用mm/h表示。

2、筛选菌株产酶活性表1-2 菌株产蛋白酶结果验证注：总酶活（U）=培养液中酶浓度（U/mL）×培养液总体积（mL）。

实验二十一发酵菌种制备【实验材料】1、菌种实验选育产蛋白酶菌株，或枯草芽孢杆菌等其它产蛋白酶菌株。

2、培养基（1）斜面培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（配方参照附录六“常用培养基”）（2）种子培养基：可溶性淀粉5g/L，牛肉膏 5g/L ，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，0.1MPa，灭菌20min。

3、实验器材三角瓶、容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、试管架。

5、实验仪器超净工作台、恒温培养箱、振荡培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、分光光度计等。

【实验步骤】1、菌种活化将实验菌种转接到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，37℃倒置培养22~24 h活化。

2、接种培养将活化菌种无菌操作接入装入50mL种子培养基/250mL三角瓶中，每瓶接2环菌苔。

接种后的培养液用蜗旋振荡均匀，32℃，180r/min摇瓶培养18~22 h，作为一级种子。

将一级种子按20%的接种量接入250 mL种子培养基/1000mL三角瓶中，32℃，150r/min 摇瓶培养16~18 h，作为二级种子。

3、种子质量检查培养后的种子培养液无菌操作取样5mL，分别作显微镜涂片染色检验细胞形态，测定培养中的菌体浓度（OD600）和蛋白酶浓度（U/mL）。

4、检测方法菌体浓度和蛋白酶含量检测参照附录九“菌体浓度检测方法”和“蛋白酶含量测定方法”。

【实验结果】1、种子液中菌种细胞形态图。

2、种子质量指标表1 种子质量指标实验二十二发酵罐结构认识及使用操作规程【实验目的】了解发酵系统的基本组成，认识典型机械搅拌通气式发酵罐的基本结构，学习发酵罐工作的一般原理，学会发酵罐使用的操作规程。

【实验内容】1、发酵罐基本结构组成（1）罐体系统：罐体、夹套、搅拌器、挡板、进料口、接种口、放料口、排气管、进气管、取样管、照明灯等。

（2）灭菌系统：蒸汽发生器、蒸汽分配管、夹套加热装置、放料口灭菌装置、通气管取样管灭菌装置、空气过滤系统灭菌装置。

（3）温度控制系统：罐内温度传感器（电极）、水箱温度传感器（电极）、恒温水箱、恒温水循环管路。

（4）无菌空气制备系统：空气压缩机、气液分离器、气体流量计、气流调节器、空气粗过滤器和空气精过滤器等。

（5）控制系统：电源开关、操作显示屏、控制器触摸开关、参数设置转换调节屏。

2、发酵罐操作规程（1）发酵罐工艺操作条件设置温度：10～50℃。

压力：0～0.3MPa(表压)。

灭菌条件；温度120～125℃，压力0～0.3MPa (表压)。

通气量：0.3～2 V/V/M。

功率消耗：0.5～4kW/m3。

发酵热量：5，000～20，000 kcal/m3．h。

（2）清洗工作清洗前应取出pH、DO电极。

清洗罐内可配合进水、进气、电机搅拌、加温一起进行。

清洗后安装要注意罐内密封圈、硅胶垫就位情况。

注意罐与罐座间隙均衡。

（3）试车将电极、电机、电缆、进出气软管、冷凝器进出水接头安装就位；安装完毕后要对罐体内通气（0.2MPa）作密封性试验。

方法如下：关闭阀门；旋紧罐体上每一个接口、堵头、电极紧固帽；打开空压机，调节气阀，使罐压保持0.2MPa左右；对系统进行2~3小时试运行，如有问题作相应处理后，方可正式使用。

（4）发酵罐使用准备如果短期内需再次培养发酵，应对其进行2~3次清水清洗待用。

如准备长期停用，则应对其进行灭菌，然后放去水箱与罐内存水，放松罐盖紧固螺丝，取出电极保养储存好，将罐、各管道余水放净，关闭所有阀门，电源，盖上防尘罩。

发酵罐操作开始前，先关闭所有出料口、取样口和进气口，打开出气阀；打开进料口螺盖加入发酵培养基，装注完成后旋上进料口螺盖，稍留空隙待灭菌升温至100℃前喷出蒸汽对螺盖灭菌处理。

（5）灭菌启动蒸汽发生器，待气压达到0.2~0.3Mpa以上时：a. 开启发酵罐出气阀，开启高压蒸汽阀将高压蒸汽通过进气阀引入夹套，打开夹套排水阀，排除蒸汽冷凝水，控制阀门开量，保持微弱出汽；b. 同时通过蒸汽分配管将蒸汽引入空气过滤系统（注意：蒸汽引入前关闭通向电器控制柜的空气阀门），使蒸汽通过一级和二级空气过滤器并顺利进入取样口出口，保持取样放出口微弱出汽；c. 另一路蒸汽通过蒸汽阀发酵罐放料口，并保持放料口微弱出汽；d.等到罐内培养基温度达到80℃时，开启与罐直接相连的通气阀，将高压蒸汽直接接入罐内加热培养基，并对与罐相连的管道灭菌。