资料四乳铁蛋白食品添加剂的质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或相关情况说明内蒙古伊利实业集团股份有限公司一、乳铁蛋白质量规格要求（一）感官指标（二）理化指标（三）微生物、污染物及真菌毒素指标二、检验方法（一）用反相高效液相层析法测定乳铁蛋白的纯度1. 样品准备对粉状乳铁蛋白，称出20 mg乳铁蛋白样品，用MilliQ水配成20 mL，1mg/mL的乳铁蛋白溶液，再通过0.2 μm的乙酸纤维素膜进行过滤。

2. 材料和试剂（1）MilliQ水（超纯水18 megohm resistivity）（2）95%的乙腈(氰化甲烷)（HPLC 级）（3）1%的三氟乙酸（TFA）2.1 缓冲液准备（1）缓冲液A：100% MilliQ水把1 L MilliQ水装在1 L 的SCHOTT瓶中。

（2）缓冲液B：95%的乙腈分别量取50 mL MilliQ水和950ml乙腈。

把二者混合，通过0.45 μm的滤膜进行过滤。

储存在1 L的SCHOTT瓶中。

（3）缓冲液C：1%的三氟乙酸用移液管量取25 mL三氟乙酸放入200 mL MilliQ水中，用MilliQ水补至250 mL。

转移到250 mL的SCHOTT瓶中储存。

3. 仪器设备（1）水基线体系控制和获得数据的设备（Empower）（2）水2695分离组件和2487双λ吸收检测器（3）反相高效液相层析柱---Alltech prosphere C4 300A 150mm × 4.6mm,with Alltech All-guard Guard 7.5 × 4.6mm.4. 高效液相层析的测量方法4.1 注射体积50 μL已过滤的乳铁蛋白样品或空白液注入柱中供分析。

4.2 梯度表4.3 温度柱子温度=35°C样品温度=10°C4.4 检测在波长280 nm处检测乳铁蛋白，乳铁蛋白的洗脱时间大约9.7分钟。

5. 过程与计算5.1 用Empower软件，用样品的层析谱减去空白溶液。

5.2 结合整个样品的层析谱，算出全部蛋白的含量。

然后结合乳铁蛋白的高峰区算出乳铁蛋白的百含量（以蛋白质为基数）。

5.3 用下面的计算公式计算乳铁蛋白的百分含量（干重）：乳铁蛋白的百分含量(干重)=[蛋白含量/(100 - 水分)]×乳铁蛋白的百分含量其中：蛋白含量是用凯氏定氮法测定的蛋白含量乳铁蛋白的百分含量是用高效液相层析法测定的乳铁蛋白含量（二）乳铁蛋白铁饱和度的测定1. 原理通过向乳铁蛋白水溶液中逐渐加入等分量的三价铁离子溶液直至乳铁蛋白铁饱和。

该过程中乳铁蛋白铁饱和度的变化在465 nm分光光度计下进行检测，当吸光值不再变化的时候说明乳铁蛋白已经完全饱和。

2. 试剂2.1 FeCl3.6H2O2.2 NTA (氨三乙酸)2.3 NaH2PO4.H2O2.4 Na2HPO4.12H2O2.5 NaHCO32.6 NaOH2.7 NaCl3.溶液的配置3.1 配置含有10 mM氯化铁和0.1 M HCl的溶液：（1）在100 mL容量瓶中分别加入：- 0.83 mL 37%的HCl- 0.270 g的FeCl3.6H2O (准确称量)（2）加蒸馏水至100 mL刻度处3.2 配置40 mM Na-NTA溶液：在100 mL容量瓶中分别加入:- 0.764 g的NTA- 加入大约20 mL去离子水- 缓慢加入1 M的NaOH溶液来溶解NTA粉末(以形成可溶的NTA钠盐)- 将1M的NaOH逐滴加入，每加入一滴并充分混合直至NTA完全溶解3.3 配置含有5mM FeCl3.6H2O和20 mM NaNTA的溶液- 将等量（各20 mL）的3.1和3.2溶液混合- 用10 M的NaOH溶液将溶液的pH值调至4-6之间（例如：4.5），但要注意尽可能少的将溶液稀释）3.4 0.1M NaHCO3的配置将8.401 g的NaHCO3加入1升蒸馏水中。

3.5 2%乳铁蛋白水溶液的配置- 将0.8 g乳铁蛋白粉末溶解于40 mL蒸馏水中- 搅动直至完全溶解4.铁饱和度的测量可以用所配置溶液来测定pH值和在600 nm时的透光率，溶液必须经过0.45 μm millipore过滤器过滤- 将1mL乳铁蛋白溶液注入比色皿- 加入1.5 mL 0.15M NaCl和200 μL的0.1 M的NaHCO3溶液- 在465 nm下测量溶液的吸光值- 加入10 μL等量的溶液3.3。

每加一次，充分混合并在465 nm下测量吸光值，直到吸光值变为恒定，也就是说乳铁蛋白趋于饱和。

5.结果的表达以纵坐标为吸光值，横坐标为等量三价铁离子浓度作图。

直线(1)为当乳铁蛋白趋于饱和时的吸光值。

直线(2)为以初始乳铁蛋白吸光值为原点到铁饱和时吸光值的连线。

将直线(2)反向延长使其与横坐标交汇。

乳铁蛋白初始铁饱和度可以通过以下两种方法计算得出：（1）通过465 nm 下最初的吸光值(b1)与饱和时溶液的吸光值(b2)的比值计算得出：1%1002b b =⨯乳铁蛋白铁饱和度（） （2）通过初始乳铁蛋白中三价铁离子的微摩尔数(a1)和饱和乳铁蛋白中三价铁离子的微摩尔数(a)的比值得出：a %=100⨯1乳铁蛋白铁饱和度（）a备注：一等份也就是每10 μL 的三价铁离子溶液=0.05 μm ol Fe 3+ 6. 乳铁蛋白浓度测定考虑到1 mol 的乳铁蛋白可以结合2摩尔的三价铁离子，因此溶液中乳铁蛋白的摩尔数应该是铁离子摩尔数的二分之一。

μmol 乳铁蛋白= 0.5×μmol Fe 3+ 乳铁蛋白分子量= 77,000因此，77,000×μmol 乳铁蛋白×10-6= 检测溶液中乳铁蛋白的质量（g ）。

（三）乳制品中乳铁蛋白含量的检测第一部分 高效毛细管电泳测定乳制品中乳铁蛋白含量A.1 适用范围本方法适用于乳粉和乳铁蛋白原料中乳铁蛋白的定性和定量分析。

A.2 原理试样经处理后进入毛细管中，在毛细管中充入缓冲溶液，两端加高电压，毛细管中形成电场。

样品中带电粒子在电场中以不同速度运动，流经检测器被检测，得到分离谱图，根据峰面积和浓度成正比的关系，计算不同成分的含量。

A.3 试剂A.3.1 实验配制所用水均为超纯水。

A.3.2 乳铁蛋白标准品（Fluka ）。

A.3.3 氢氧化钠：1 moL/L 溶液。

A.3.4 硼酸（sigma）。

A.3.5 CsOH（50 %水溶液，北京百灵威化学技术有限公司）。

A.3.6 冰乙酸（优级纯）。

A.3.7 十二烷基硫酸钠(SDS，Sigma-Aldrieh，货号:L3771)。

A.3.8 羟乙基纤维素(HEC，Sigma-Aldrieh，货号:54290)。

A.3.9 HEC储备液的配制：HEC是一种淡黄色粉末状固体，首先准确量取100 mL超纯水置于试剂瓶中，将其放置在60 ℃水浴中加热，将准确称量的4 g HEC 逐步加入，涡旋混匀，待其完全溶解即配制成40 g/L的HEC储备液，放入4 ℃冰箱备用。

A.3.10 运行缓冲液：0.3 moL/L硼酸，其中含20 mmoL/L SDS和8 g/L HEC。

首先分别准确称取1.855g硼酸和0.577 g SDS放入100 mL容量瓶中，加入70 mL的超纯水，超声使其溶解，然后再加入20 mL质量浓度为40 g/LHEC储备液，涡旋混匀后用1 moL/L的CSOH调节pH值到8.80，最后用超纯水定容到刻度线，室温放置备用。

A.3.11 样品缓冲液：0. 05 moL /L HAC。

准确移取 1.437 mL冰醋酸置于500 mL 容量瓶中，用超纯水定容到刻度，放入4 ℃冰箱备用。

A.4 仪器A.4.1 毛细管电泳仪（带有紫外检测器）。

A.4.2 电子天平。

A.4.3 pH计。

A.4.4 超声振荡器。

A.4.5 高速离心机A.5 操作步骤A.5.1 样品的前处理分别称取一定质量的的样品于10 mL容量瓶中，加入适量样品缓冲液，涡旋混匀后，再用样品介质稀释定容到刻度，于9000 r/min离心10 min，取上清液分析。

A.5.2 测定A.5.2.1 标准曲线的绘制准确称取10 mg乳铁蛋白标准品于l mL样品管中，加入1.5 mL样品介质涡旋混匀后，制得10000 mg/L的乳铁蛋白标准储备液，放入4 ℃冰箱备用。

工作液由储备液经0. 05 mol/L HAc 稀释后制得。

准确移取10、20、40、80、160 mg/L质量浓度为5000 mg/L的Lf标准储备液于l mL样品管中，再分别加入990、980、960、920、840 mg/L样品缓冲液，混匀后即得50、100、200、400、800mg/L的工作液。

峰面积(A)与质量浓度(C，mg/L)在50~800 mg/L范围内具有良好线性关系，检出限(LOD)为15 mg/L。

A.5.2.2 试样测定测定条件毛细管(50 um×57 cm，有效长度:50 cm，河北永年锐沣色谱配件有限公司)；分离电压:20kV；检测波长:214 nm；操作温度:25 ℃；进样压力：0.5 psi；进样时间:20 s。

每次实验完毕后，用运行缓冲溶液洗3 min，用1 moL/L氢氧化钠洗10-30 min，水洗3 min，抬高盖板使冷凝液回流后，关机。

使用新换的毛细管柱需要用水洗10 min，用1 moL/L氢氧化钠清洗30 min，水洗10 min，进行柱子的活化。

然后可以进行样品的测定。

(清洗压力均为20 psi) A.6 分析结果的计算计算公式: X = C * N/m式中：X——样品中乳铁蛋白的含量mg/kg；C——从标曲中查得相应乳铁蛋白的含量mg/L；M——称取试样的质量g；N——稀释倍数×定容体积。

第二部分酶联免疫法A.7 原理本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。

将标准品、待测样本加入到预先包被牛乳铁蛋白（LF）单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。

依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中牛乳铁蛋白（LF）浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中牛乳铁蛋白（LF）含量。

A.8 试剂盒组成及试剂配制A.8.1 酶联板：一块（96孔）A.8.2 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1 mL，盖好后静置10 min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成100 ng/mL,50 ng/mL,25 ng/mL,12.5 ng/mL,6.25 ng/mL,3.12 ng/mL,1.56 ng/mL其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0ng/mL，临用前15 min内配制。