靶向沉默RACK1基因对肺腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用目的：研究沉默RACK1基因对人肺腺癌细胞株A549裸鼠皮下移植瘤生长的影响。

方法：使用人肺腺癌细胞株A549建立裸鼠皮下移植瘤模型。

待肿瘤直径为0.3～0.5 cm时将荷瘤裸鼠随机分成3组，每组6只，分别于瘤内注射生理盐水（空白组）、空载质粒-脂质体复合物（空载组）及shRNA-RACK1质粒-脂质体复合物（实验组）。

观察三组裸鼠的皮下移植瘤体积变化，绘制肿瘤生长曲线，并用Western blot检测各组肿瘤组织中RACK1蛋白的表达。

结果：移植瘤形成后第28天，与空白组和空载组比较，实验组移植瘤生长速率、肿瘤体积和重量均明显降低（P＜0.05）。

转染干扰载体RACK1-shRNA对裸鼠肺腺癌移植瘤的的抑瘤率为39%。

Western blot结果显示，实验组移植瘤组织中RACK1蛋白的表达明显低于空白组和空载组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

结论：沉默RACK1基因对肺腺癌裸鼠移植瘤生长有明显抑制作用。

RACK1（receptor for activated protein kinase C-1）是RACKs家族中第一個被识别的成员，该蛋白结合能力广泛，功能多样，在细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭等过程中发挥重要的作用。

文献[1]报道，RACK1在肿瘤组织中表达升高。

有研究表明RACK1与口腔鳞癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌的发生发展密切相关，并且与肿瘤的病理分期、淋巴结转移、预后和治疗效果也有关[2-9]。

课题组前期研究发现RACK1基因促进了肺腺癌的发生发展，并且通过体外试验证明沉默RACK1蛋白在肺腺癌細胞株A549内的表达可以抑制肿瘤细胞的生长，并且提高了A549细胞对顺铂和紫杉醇两种化疗药物的敏感性[10-11]。

本研究将在前期工作的基础之上观察RACK1对肺腺癌动物模型肿瘤生长的影响，以期为以RACK1为靶点的肺腺癌基因治疗提供理论和实验依据，现报道如下。

1 材料与方法1.1 实验材料A549细胞株由山西医科大学生化实验室馈赠，胎牛血清购自杭州四季青公司，0.25%胰酶购自美国Sigma公司，shRNA表达载体试剂盒购自上海生工生物工程技术公司，Lipfectamine 2000购自美国invitrogen 公司。

1.2 质粒制备据shRNA设计原则，设计并合成RACK1基因干扰寡核苷酸序列，正义序列：5’-CACCGAGATAAGACCATCATCATGTT TCAAGAGAACATGATGATGGTCTTATCTCTTTTTTG-3’反义序列：5’-AGCTCAAAAAAGAGAT AAGACCATCATCATGTTCTCTTGAAACATGATGATGGTCTTATCTC-3’shRNA DNA：GAGATAAGACCA TCATCATGTTTCAAGAGAACATGATGATGGTCTTATCTCTT shRNA 结构：。

1.3 人肺腺癌裸鼠移植瘤模型的建立雄性BALB/C裸小鼠[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号SCXK（湘）2011-0003]，4周龄左右，体重18～22 g。

实验前于山西医科大学动物实验中心SPF级饲养1周，观察裸小鼠的生长情况。

人肺腺癌细胞株A549用含有10%胎牛血清的F12K培养液在37 ℃、5%CO2条件下培养。

细胞生长至对数生长期，用0.25%胰酶消化，用PBS制成细胞悬液，调整细胞密度至1×107/mL。

于裸鼠背侧近后肢处皮下碘消毒并且皮下注射细胞悬液0.2 mL，注射后裸鼠继续饲养于SPF级环境中，待裸鼠肿瘤长径为0.3～0.5 cm时，将荷瘤裸鼠随机分为3组，分别为RACK1-shRNA（实验组）、Vector-shRNA（空載质粒组）和Control（空白对照组），每组6只。

实验组裸鼠瘤体内多点注射shRNA质粒-脂质体复合物（20 μg质粒+30 μL脂质体+50μL无血清F12K培养基），严格按照脂质体2000的转染说明进行操作；空载质粒组裸鼠瘤体内多点注射空载质粒-脂质体复合物，空白对照组裸鼠瘤体内多点注射生理盐水，空载质粒组和空白对照组剂量同实验组。

隔日注射一次，连续注射6次。

记录肿瘤生长大小，于28 d时处死，剥离肿瘤，提取肿瘤组织的总蛋白，测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，并进行Western blot，使用Bandscan分析软件分析。

1.4 移植瘤生长状况的观察每天观察裸鼠精神、活动及大便情况，注射第7、14、2l、28天测量裸鼠体重和移植瘤的最长直径（a）和最短直径（b），按公式V（mm3）=πab2/6计算移植瘤体积，抑瘤率=（1-实验组肿瘤体积/空白组肿瘤体积）×100%。

停药24 h终止观察，处死裸鼠，剥取瘤组织，测量体积并称重。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 转染RACK1-shRNA对裸鼠移植瘤生长的影响皮下注射细胞后3～5 d，空载质粒组和空白对照组裸鼠可在注射部位发现约小米粒大小的肺腺癌移植瘤形成，镜下观察可见移植瘤为肺腺癌组织，而实验组裸鼠移植瘤出现时间有所延迟。

移植瘤形成后第28天，空载质粒组和空白对照组移植瘤体积生长至绿豆般大小，而实验组裸鼠移植瘤体积相对较小，见图1、2。

绘制生长曲线显示，实验组移植瘤体积增大速度明显慢于空载质粒组和空白对照组，而空载质粒组和空白对照组移植瘤体积增长速度基本无差别，见图3。

于移植瘤模型建立后28 d 处死裸鼠，对肺腺癌移植瘤进行取材并测量其体积和重量。

结果显示空载质粒组和空白对照组移植瘤体积和重量明显大于实验组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

空载质粒组和空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1和圖4。

2.2 Western blot法检测肿瘤组织内RACK1蛋白的表达Western blot结果显示，实验组、空载质粒组和空白对照组中RACK1相对表达量分别为（0.21±0.11）、（0.76±0.08）及（0.83±0.05）。

与空载质粒组和空白对照组相比，实验组RACK1蛋白的表达量显著降低，差异均有统计学意义（F=97.53，P＜0.05），空载质粒组和空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

shRNA表达载体转染后可下调RACK1蛋白在肺腺癌中的表达，见图5。

3 讨论肺癌在我国是比较常见的恶性肿瘤，发病率和病死率呈上升趋势，而其生物学行为尚未完全清楚[12]。

深入研究肺癌侵袭转移的机制，积极探索有效的预防和治疗措施，是当前肺癌研究中的重点和难点，随着分子靶向药物的应用，明显改善了患者的临床疗效。

阮元元等[13]对肝癌的临床研究表明，RACK1在肝癌细胞系中发挥了化疗抵抗的功能。

沈芳荣等[14]通过下调RACK1表达证实在体内外实验中前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力均下调。

Hu等[7]证实了RACK1促进了食管鳞癌细胞的生长与转移。

杨丹丹等[8]研究表明RACK1对于宫颈癌的发生发展是一个促发因素。

在本实验中笔者建立了裸鼠皮下移植瘤模型，采用脂质体转染方法抑制肺腺癌细胞A549中RACK1基因的表达，蛋白印迹定量分析结果显示：转染干扰载体RACK1-shRNA的肺腺癌移植瘤RACK1蛋白表达明显受到抑制。

通过绘制并对比生长曲线显示转染干扰载体RACK1-shRNA后21、28 d移植瘤生长明显减慢，提示RACK1基因沉默可以减缓肺腺癌细胞A549的体内成瘤过程，于28 d 处死裸鼠，称量移植瘤体积与重量，显示实验组裸鼠移植瘤体积和重量明显低于空载质粒组和空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），RACK1-shRNA组抑瘤率达39%。

本研究通过观察抑制RACK1基因对肺腺癌细胞A549在活体动物体内生长的影响，为了解RACK1在肺腺癌发生发展中的作用机制、RACK1分子靶向治疗肺腺癌提供了体内实验依据。

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