细菌纤维素/纳M银复合材料地制备及其抗菌性能研究摘要：细菌纤维素<bacterial cellulose, bc）是一种由微生物合成地高纯度纤维素,超细纤维网络结构使其具有高比表面积、高持水能力以及良好地生物相容性和生物可降解性,被认为是一种潜在地“理想”医用敷料材料.然而,细菌纤维素本身不具有抗菌性能,难以应对细菌感染地伤口.纳M银是一种广谱抗菌剂.因此本文以细菌纤维素为模板,采用环境友好地化学还原剂抗坏血酸为还原剂,原位制备细菌纤维素/纳M银复合材料.同时分别采用抑菌圈法和最小抑菌浓度法对复合物地抗菌效果进行评价.
关键词：细菌纤维素纳M银抗菌创伤敷料
一、引言
细菌纤维素是一种由微生物合成地高纯度纤维素,其微纤维直径只有40-60nm,是自然界中天然存在地精细纳M材料.超细纤维网络结构使其具有高比表面积、高持水能力以及良好地生物相容性和生物可降解性,被称作“大自然赋予人类地天然生物医用材料”[1].大量研究和临床实验表明,细菌纤维素基创伤敷料对于烧伤烫伤以及慢性溃疡疾病具有良好地治愈效果,是一种极具潜力地“理想”创伤敷料材料[2].
然而,细菌纤维素本身不具有抗菌性能,难以应对细菌感染地伤口.金属银及其化合物是目前最常用地无机抗菌剂,尤其适用于治疗烧伤烫伤以及慢性溃疡创伤[3].因此,以细菌纤维素为载体负载纳M银粒子将有望获得具有高效保湿抗菌功能地“理想”医用创
伤敷料.孙东平等以细菌纤维素为载体,甲醛为还原剂采用液相化
学还原法合成载银细菌纤维素复合材料,所得银纳M粒子平均粒径在45nm左右,对大肠杆菌、酵母菌和白色念珠菌等都有理想地抗
菌效果[4].marques等分别以细菌纤维素和普通植物纤维为基体,采用nabh4原位还原agno3地方法在纤维素膜上合成纳M银单质,结果表明细菌纤维素纤维地银负载量可达到植物纤维地50倍以上,并且对ag+具有更持久地控释作用,是一种良好地纳M银合成基质[5].上述研究大多采用nabh4、甲醛等化学试剂为还原剂,这些试剂通常具有较高地人体毒性,反应结束后很难解决试剂在纤维膜内地残留问题,尤其不适合应用于生物医用材料产品地制备.据此,我们提出,以细菌纤维素为模板,摒弃有毒化学还原试剂,采用环境友好地抗坏血酸为还原剂,原位制备细菌纤维素/纳M银复合材料. 二、材料与方法
<一）实验材料
木醋杆菌<acetobacter xylinum）：本实验室保藏.agno3、抗
坏血酸购买于国药集团化学试剂有限公司.其它试剂若无特殊说明,均为市场可售.
<二）细菌纤维素膜地制备和纯化
以木醋杆菌为菌种,将活化后地菌种接种至种子培养液中,在30℃和160rpm地摇床中培养24h.按6%地接种量接种于发酵培养
基中,30℃恒温培养箱中静置培养8 d,得细菌纤维素膜.培养基组成为麦芽糖25g/l,蛋白胨3g/l,酵母浸膏5g/l,ph值为5.0,121℃
灭菌20 min.
将bc膜取出用去离子水反复冲洗,再浸泡于0.1%地naoh溶液中以去除细菌纤维素膜中地菌体及残留培养基,80℃处理6h至膜呈乳白色半透明.最后用去离子水充分洗涤,直至洗液成中性.
<三）细菌纤维素/纳M银复合材料地制备
将上述bc膜浸泡于一定浓度地硝酸银溶液中,在30℃恒温水浴锅中100rpm震荡12h.然后将膜取出放入10mm地抗坏血酸溶液中,在磁力搅拌下冰浴还原6h.然后取出用去离子充分洗涤,得细菌纤维素/纳M银复合材料.
<四）含银量地测定
将制备地复合物样品干燥后剪碎,准确称取一定质量溶解于hno3溶液中.采用原子吸收法测定其银含量.
<五）抗菌性能地测定
<1）抑菌圈法
以金黄色葡萄球菌为模型菌.具体方法为：将金黄色葡萄球菌从斜面接种到种子培养基中,37℃恒温培养12h得种子液.吸取0.1ml 种子液至固体平板培养基上,涂布均匀.将载银细菌纤维素膜平铺在平板中央,37℃恒温倒置培养24h.然后测量其抑菌圈大小,并以不载银地纯细菌纤维素膜为对照组.抑菌带宽度定义为：抑菌带半径平均值与样品膜半径平均值之差.
<2）最小抑菌浓度法<mic）
以金黄色葡萄球菌为模型菌,采用mic法定量评价复合物地抗菌
效果.具体方法为：将10个灭菌地含一定量培养基地三角瓶分别编号1-9号,在培养基中放入1-9片载银细菌纤维素膜制成不同含银量培养基.然后,取107cfu/ml地金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml 接种于上述1-9号三角瓶中,于37℃恒温培养24h.
培养结束后,分别从上述三角瓶中取出0.1ml培养液,将其涂布到琼脂平板上,每个样品做三个平行,于37℃恒温培养箱中倒置培养24h,观察菌落地生长情况.以不长菌地最低浓度为最小抑制浓度<mic）.
三、结果与讨论
<一）细菌纤维素/纳M银复合材料地制备
目前化学法还原制备纳M银粒子大多采用nabh4、甲醛等化学试剂为还原剂,这些试剂通常具有较高地人体毒性,反应结束后需解决试剂在纤维膜内地残留问题,不适合应用于生物医用材料产品地制备.抗坏血酸是一种常用地医药原料,具有一定地还原能力.因此本文尝试以抗坏血酸为还原剂,细菌纤维素为模板,原位还原制备纳M银.实验过程中发现,随着反应时间地延长,细菌纤维素膜由初始地透明色逐渐变为亮黄色,表明纳M银粒子在细菌纤维素膜上形成<图1）.
<二）含银量地测定
分别选用1.0、2.5及5.0mm地硝酸银溶液制备细菌纤维素/纳M 银复合材料,采用原子吸收法测定不同硝酸银溶液浓度条件下复合物地载银量情况,结果如图2所示.结果显示,随着硝酸银浓度地升
高,复合膜地含银量增加.但当硝酸银浓度大于2.5mm时,继续增加硝酸银浓度,复合物地载银量几乎不变,这说明此时可能达到了细
菌纤维素膜地最大银负载量.
<三）抗菌活力地评价
首先采用抑菌圈法对细菌纤维素/纳M银复合材料地抗菌活力进行定性评价.分别考察了上述三种硝酸银溶液所制备地复合物地抗菌效果<图3）.如图所示,复合物产生地抑菌圈地变化趋势与其载银量相似,这说明复合物载银量地高低与抑菌圈宽度有一定相关性,即载银量越高,抑菌圈越大.
采用最小抑菌浓度法定量评价细菌纤维素/纳M银复合材料地抗菌活力,如图4所示.由结果可知,当硝酸银浓度为1.0mm时,mic值最低,说明该制备条件下,复合膜地抗菌效果最好.在较高地硝酸银浓度条件下,由于较高量地银粒子负载到细菌纤维素膜上,可能会
产生银粒子团聚,进而影响其抗菌效果.
四、结论
本文以细菌纤维素为模板,抗坏血酸为还原剂,原位制备细菌纤
维素/纳M银复合材料,并对其抗菌活性进行研究.结果表明,在较
低地硝酸银浓度条件下,所得复合膜地载银量较低,抑菌圈较小,但其最小抑菌浓度值较低.这可能是由于较低地银负载量减弱了银粒子地团聚现象,导致其抗菌效果较好.
基金工程：国家自然基金工程<no.21004008）；上海市教育委
员会和上海市教育发展基金会“晨光计划”工程<no.11cg35）.
[参考文献]
[1]czaja w,krystynowicz a,bielecki s,brown r
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[2]alvarez o m,patel m,booker j,markowitz
l.effectiveness of a biocellulose wound dressing for the treatment of chronic venous leg ulcers:results of a single center randomized study involving 24
patients.wounds,2004,16:224-233.
[3]rai m,yadav a,gade a.silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials.biotechnol.adv.,2009,27:76-83.
[4]孙东平,杨加志,李骏,周伶俐,于俊伟.载银细菌纤维素抗菌敷料地制备及其抗菌性能地研究.生物医学工程学杂志,2009,26：1034-1038.
[5]pinto r j,marques p a,neto c p,trindade t,daina
s,sadocco p. antibacterial activity of nanocomposites of silver and bacterial or vegetable cellulosic fibers.acta biomater.,2009,5:2279-2289.。