人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒
英文名称：Shuwen® Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR
【包装规格】
7测试/盒
【预期用途】
EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。

EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。

通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。

EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。

EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。

其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。

目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。

外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和
2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。

另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。

本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。

本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。

【检测原理】
本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。

利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。

【主要组成成分】
本试剂盒具体包含组分如表1
表1
【储存条件及有效期】
避光，-20℃以下保存，避免反复冻融(不要超过5次)，有效期6个月。

【适用仪器】
ABI 7300，ABI 7500，ABI 7900，ABI StepOne，ABI StepOne Plus，Rotor-Gene Q
【样本要求】
本试剂盒可以检测从新鲜组织及FFPE组织中提取的DNA，DNA质量及浓度影响检测的特异性和灵敏度。

DNA的质量与样本保存时间、样本组成、DNA提取方法密切相关；而且所采集的临床样本中正常组织细胞的混杂程度也不同，因此对样本做如下要求：
1、新鲜标本的制备过程中，术后标本取下后应立即放入-20℃以下冰箱中保存；石蜡包埋组织制备过程中，
术后标本应在1 个小时内放入10％中性缓冲福尔马林溶液中固定，用量应为组织块的4-20 倍，固定时间应在6-48 小时之间；
2、新鲜组织样本，要确保含有肿瘤细胞大于1%，尽量减少正常组织、间质及坏死组织，推荐使用商业化
试剂盒提取DNA(AXYGEN，QIAGEN等公司产品)。

提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，
A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于-20℃保存。

3、FFPE组织样本，要确保含有肿瘤细胞，尽量去除坏死组织及石蜡边缘，推荐使用商业化试剂盒提取
DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)。

提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，A260/A280在
1.6-
2.0之间，如果不能立即检测请置于-20℃保存。

FFPE组织样本保存年限尚未超过3年。

4、样本切片规格要求为：横切面面积至少6m m×6mm，厚度10µm，3片，如果切片面积小请适当增
加切片数。

最终提取的DNA用100µL-200µL水溶解，分光光度计检测浓度后，稀释或浓缩成5-10ng/µL。

【检验方法】
本试剂盒可以进行5人份的检测反应，并为每个样本额外提供一个参照基因扩增反应，用于估测样本实际DNA的浓度。

建议每批次实验都检测一个阳性对照(positive control)和一个无模板阴性对照(NTC)。

建议根据实验条件进行分区操作，如样品处理区，反应液配制区等。

具体操作步骤如下：
1.将试剂盒中所有组分冰上融化，涡旋混匀并短暂离心，放置于冰上。

[注意：试剂盒中的所有试管在开
盖前均应短暂离心，以免粘在管口或管盖上的试剂在开盖时被污染。

]
2.每批实验根据待检测样本数、一个阳性对照、一个阴性对照，同时计算并分别配制1-8号反应液。

每
个反应液所需反应数=待测样本数+ 2（一个阳性对照、一个阴性对照），而每个反应所需反应液
19.7µL，需r-Taq酶0.3µL，即从1-8号反应液中分别取（19.7×反应数）µL于对应编号的1.5EP管，
再分别加入（0.3×反应数）µL的r-Taq酶。

[注意：由于取样误差，请根据情况适当多配置0.3个反应即可。

]
3.将配制好的混合液轻轻充分混匀，并按照每管20µL分装到每个PCR反应管中。

4.然后向每个反应管中加入5µL待检测DNA、或阳性参照、或水(试剂盒提供)。

待检测样本最佳浓度范
围为5ng/µL-10ng/µL，即每个反应管中有效DNA总量为25-50ng。

5.短暂离心消除反应管中的气泡，将PCR反应管放入PCR仪。

样本在PCR反应板中的布局可参见表2
表2 建议布局
6.打开操作软件，设置PCR扩增程序为
Stage1：95℃ 5min
Stage2：95℃ 20s，57℃ 32s ，5个循环
Stage3：95℃ 20s，60℃ 32s ，40个循环收集FAM信号
注：如果使用ABI定量PCR仪，将“Passive Reference”设置为“None”, “reporter”设置为“FAM”，“quencher”设置为“TAMRA”
【参考值】
检测结果Array判定：
1.当样品CT值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。

2.当样品CT值小于阴性临界值时，则该样品为阳性。

表3 结果判定
【实验结果的解释】
1.阈值设定：针对ABI7500机型，对以上9种检测分别设定阈值，其中19-del(1) ,19-del(2)和G719X
阈值设定为12000，其他为30000
2.阴性无模板空白对照(NTC) 应无扩增曲线升起；否则表明此次实验结果无效，建议更换操作环境或反
应试剂，重新试验。

（若只稍稍升起，但对结果判断无显著影响，则结果依然有效）
3.阳性对照Ct值一般小于25，参照基因体系的阳性对照CT值一般小于23，但须根据仪器型号等情况进
行判断。

4.CT值确定：建议对于一个突变检测体系应同时选择参照基因反应管，STD反应管，NTC和样品反应
管，一并划定阈值，从而得到外控CT值和样品的突变CT值。

5.参照基因CT值应控制在23之前，以用于评估反应体系中的DNA模板量。

若外控CT值大于23，说明
加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量太少，需重新提取或增大DNA加入量再做。

(仅对全阴性结
果而言；若已经判断为阳性，结果仍然可靠)
附表：。