实习报告题目：生物腐殖酸高产菌株的筛选姓名：黄兆峰学号：080500130学院：生物科学与工程学院专业：微生物工程年级：2005生物腐植酸高产菌株的筛选摘要：腐植酸（Humic Acid, 简称 HA）是有机物质经微生物一系列分解和合成而形成的一种多种类分子有机物，它广泛存在于风化煤、泥炭和褐煤中，目前已在工农业、医学与环境保护等方面发挥着重要的作用。
福建省诏安县绿洲生化有限公司自主研制的生物腐植酸，富含多种有益微生物，已在水产养殖、水质改良、发酵泥炭生产高养分绿色环保肥料等方面取得了良好的社会经济效益。
但由于生产仍是土法建堆的模式，并未筛选功能明确的发酵菌种进行发酵，因此存在产酸低、产品质量不稳定等缺陷。
为此，本课题以工厂发酵原料与发酵产品为基质，进行腐植酸高产菌株的分离筛选，测试初筛的单一菌株产腐植酸的能力，并开展了优势单一菌株的复合发酵与扩大发酵研究，结果如下：1）从发酵蔗渣原料与发酵产品中进行菌种分离，经耐45℃高温和降解纤维素试验，共初筛获得12株能在45℃下生长且降解纤维素良好的菌株，其中细菌11株，霉菌1株。
2）将初筛的菌株以模拟工厂发酵生产腐植酸的条件对其产腐植酸能力进行测试。
通过300ml三角瓶发酵,以产腐植酸为指标，测定分离菌株25号菌和A号菌产腐植酸为最优，12#和E号菌次之。
其中25号菌株腐植酸含量增长为6.98%，A号增长6.63%，12号菌增长5.63%， E号增长5.22%。
由于A号菌为霉菌，所以暂不考虑其发酵能力。
故筛选出12号菌，25号菌和E号菌为优势菌株。
关键词：菌种筛选，腐植酸含量，分离纯化第一章前言1.1腐植酸的概述腐植酸（Humic Acid, 简称 HA）是有机物质经微生物一系列分解和合成而形成的一种多种类分子有机物，它广泛存在于风化煤、泥炭和褐煤中。
近年来，腐植酸类物质的应用越来越广，涵盖了农业、医药、工业等多个领域。
腐植酸在农业上的应用以肥料为主。
一方面，其本身就可以促进作物呼吸和新陈代谢、促进各种酶特别是糖转化酶的活性、促进细胞发育和植物生长、增强植物吸收养分能力等，从而提高作物的产量。
另一方面，腐植酸对化肥和微肥有明显的增效作用，它能与化学肥料复配成有机—无机复合肥，增加肥效，减少化肥被固定和流失，提高化肥的利用率；同时，腐植酸结构单元上含有羧基、羟基、醇羟基、醌基、半醌基、甲氧基、烯醇基、胺基等多种活性功能团，作为一种源广价廉的天然螯合剂，腐植酸与土壤中难溶于水的微量元素等螯合后使得微量元素很容易被作物吸收和运转。
自然界腐植酸广泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋以及煤炭中。
我国是腐植酸资源大国，其资源储量大，分布广，品位好[1，2,3]。
近年来，我国也通过秸杆发酵生产人工合成腐植酸类物质的生化腐植酸[4]。
腐植酸类物质的基本性质和特征决定了它在保持农业生态系统健康中有着重要的应用意义，因而也越来越引起人们的重视[5]。
1.2 腐植酸的形成关于腐植酸形成的微生物学机理在20世纪主要有七种影响着我国学术界。
一是瓦克斯曼提出的木质素----蛋白质复合体学说；二是威廉斯提出的微生物作用学说；三是微生物合成假说；四是植物和微生物细胞自溶假说；五是科诺诺娃学说；六是恩德斯提出的植物残体形成腐植酸的过程和煤化机制；七是我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论,即水解阶段—产酸阶段—合成和聚合阶段。
指出参与厌氧发酵形成腐植酸的微生物不是一个纯菌种,而是由多个微生物生理群联合作用的结果。
在此对我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论进行阐述。
边文骅学者从自然界选取优质活性污泥为菌种，在室内富集培养扩大，优化生产条件，在500mL、5000mL发酵器发酵试验的基础上，扩大为1m3、20m3环流厌氧发酵器的中试生产规模均获得了良好的效果。
从而认识到，腐植酸是有机物质（动、植物残体）在适当的温度、湿度、酸碱度和厌氧条件下，通过功能不同的多种微生物的代谢，形成腐植酸的过程，这一过程大概分为三个阶段。
第一阶段，或称水解阶段，由发酵细菌产生胞外酶水解大分子有机物质如纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、果胶质、脂肪和蛋白质等。
根据他们作用的底物不同，分别称为纤维素分解菌、半纤维素分解菌、木质素分解菌、淀粉分解菌、脂肪分解菌和蛋白质分解菌等生理群，在它们的作用下，多糖类物质水解为单糖，蛋白质水解为肽和氨基酸，脂肪水解成甘油和脂肪酸。
第二阶段，或称产酸阶段，进入细胞的各种可溶性物质，在各种胞内酶的作用下进一步分解代谢，生成多重挥发性脂肪酸和醇,如乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、乳酸、甲醇、乙醇等，同时出现许多活性基团，如-OH、-COOH等。
第三阶段，或称为合成和聚合阶段，在微生物细胞内合成，菌体死亡后释放出来或在细胞外通过聚合作用生成腐植酸[6]。
1.3 腐植酸分类腐植酸分类因其形成与来源方式而不同。
按照腐植酸的形成方式分为两大类：天然腐植酸和人工腐植酸。
前者包括土壤腐植酸、水体腐植酸和人工腐植酸；后者包括生物发酵腐植酸、化学合成腐植酸和氧化再生腐植酸。
按照腐植酸来源的方式分为三大类：原生腐植酸、再生腐植酸与合成腐植酸。
原生腐植酸是天然物质的化学组成中所固有的腐植酸。
再生腐植酸是指各阶段煤经过自然风化或人工氧化方法生成的腐植酸。
合成腐植酸通常系指用人工方法从非煤类物质所制得的与天然腐植酸相类似的物质[7]。
1.4 腐植酸的提取腐植质是一类广泛存在于自然界的天然高分子有机物。
它具有比表面积大、结构复杂、带有多种活性官能团，能够与许多有机、无机物发生相互作用。
在工农业、医药、环保等领域有广泛的用途。
腐植质的主体是腐植酸与金属离子相结合的盐类，要想得到腐植酸，就必须将其从土壤或溶液中提取出来，但较为困难，腐植质根据其溶解性质可以分为3个级分：富里酸（既溶于酸又溶于碱），腐植酸（只溶于碱而不溶于酸），胡敏素（不溶于酸和碱）。
思路是：先将土壤或溶液中未分解或部分分解的动植物残体分离，然后用不同的溶剂来浸提土壤或溶液，最终得到腐植酸。
腐植酸的提取方法主要有三种：酸抽提法、碱抽提法和微生物溶解法。
酸抽提法首先在原料中加入稀酸混匀，进行蒸汽煮沸并搅拌，后进行过滤或离心，取上清液水洗至pH=5后收集沉淀物即得到腐植酸[8]。
碱抽提法与酸抽提法操作相似，首先加入碱抽提剂（氢氧化钠或碳酸钠），使原料中的腐植酸生成水溶性的腐植酸钠，将其与原料进行分离，将得到的腐植酸钠溶液进行酸化，生成腐植酸析出。
可在碱抽提前进行空气氧化预处理、硝酸氧化预处理或超声波预处理，以提高腐植酸的提取率[9]。
微生物溶解法先将培养基分装，灭菌后接入特定的微生物，生长一段时间后加入一定量的腐植酸灭菌样品，然后置于培养箱或摇床中，使菌、胞外液、培养液与腐植酸接触并发生作用。
待溶解的腐植酸使培养液染成较深的颜色后，测定一定加样天数里腐植酸的转化率。
方法是将培养液与菌和未转化的腐植酸分离，得到溶液用硫酸使转化为腐植酸沉淀下来[10]。
三种方法各有各的优缺点，酸抽提法比较早的操作坊法，简单，易于操作，生产周期短，而且省去碱法使用的碳酸物，因此酸抽提法价格比较低，但是酸抽提剂法后的腐植酸因含杂质太多,使其应用受到限制。
碱抽提法是目前主要使用的方法，操作同样简单，周期短，只是使用得碱抽提剂的价格比较贵。
微生物溶解法是新兴的方法，其反应温和，可清洁转化，产物生物活性高，缺点是反应周期长，产率低，现主要作为实验研究。
1.5 腐植酸的性质1.5.1 溶解性腐植酸能或多或少地溶解在酸、碱、盐、水和一些有机溶剂中，因而可用这些物质作为腐植酸的抽提剂。
这些抽提剂一般分为碱性物质（如KON、NH4OH、Na2CO3、Na4P2O7等）、中性盐（如NaF、Na2C2O3等）、弱酸性物质（如草酸、柠檬酸、苯甲酸等）、有机溶剂（如乙醇、酮类、吡啶等）和混合溶液（NaOH和Na4P2O7混合）五类[11]。
1.5.2 胶体性质腐植酸是一种亲水胶体，低浓度时是真溶液，没有粘度；而在高浓度时则是一种胶体溶液或称分散体系，呈现胶体性质。
当加入酸类或高浓度的盐类物质时可使产生凝聚，一般使用稀盐酸或稀硫酸，保持溶液pH在3～4之间时，此溶液经静止后就能很快析出絮状沉淀[12]。
1.5.3 酸性腐植酸分子结构中有羧基和酚羟基等基团，使其具有弱酸性。
所以腐植酸可以与碳酸盐、醋酸盐等进行定量反应。
腐植酸与其盐类组成的缓冲哦、溶液，可以调节土壤的酸碱度，使农作物在适宜的pH值条件下生长。
1.5.4 离子交换性腐植酸分子上的一些官能团，如羧基-COOH上的H+可以被Na+、K+、NH4+等金属离子置换出来而生成弱酸盐，所以具有较高的离子交换容量。
腐植酸的离子交换容量与pH有关，当pH从4.5提高到8.1时，腐植酸的离子交换容量从1.7mol/g增加到5.9mol/g。
1.5.5 络合性能由于腐植酸含有大量的官能团，可以与一些金属离子（Al3+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Cr3+等）形成络合物或螯合物。
腐植酸结构中参与金属漯河或螯合的官能团一般是羧基和酚羟基，可能还有羰基和胺基。
1.5.6 生理活性腐植酸的生理活性系指腐植酸促进生物体生理活动的能力。
腐植酸的生理活性在植物上表现为刺激植物生长代谢、改善子实质量和增强植物抗逆能力，但与腐植酸的浓度和腐植酸的分子量大小有关系[13]。
1.6 本课题选题依据1）目前为止，我国生物腐植酸行业还处于初级阶段，生物腐植酸发酵厂采用的发酵方法主要是人工堆建发酵法，产量低、产品质量不稳定，某些生产环节（如干燥）仍依赖于自然条件，通过酸碱反应提取腐植酸液，提取率低，而且生产的生化腐植酸农用产品中含有益菌数量较低；2）福建省诏安县绿洲生化有限公司采用枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和自然菌群复合发酵甘蔗渣制取生物腐植酸，不但含量较高，而且产品中保留了大量有益菌，使产品功能更趋丰富。
但目前该公司还处于中试生产规模，现有菌种的蔗渣转化和产酸能力还有待进一步提高，发酵和干燥等生产工艺还有待进一步改进。
3）中国腐植酸工业协会和专家学者多次提倡生物腐植酸行业应规模化、机械化，应以定向菌种提升产品功能，实现生物腐植酸的产业化生产。
1.7研究内容与创新点1.7.1 研究内容1）菌种分离以纤维素筛选培养基为基础，从不同蔗渣原料及腐植酸产品中分离筛选耐高温的纤维素降解菌，主要分离纯化细菌和霉菌，并获得单一菌株。
2）菌种初筛以工厂发酵生产腐植酸模式为条件，研究各单一菌株产腐植酸的性能，以活性腐植酸产量为指标，筛选能高效生产腐植酸的菌株。
1.7.2 创新点本课题从现有发酵原料和发酵产品中分离能高效分解蔗渣并转化成活性腐植酸的菌株，并对初筛的菌株进行单一发酵和组合发酵生产腐植酸进行研究，这为后续以定向菌种提升产品功能，实现生物腐植酸的产业化生产奠定良好基础。